实验中慢病毒的干扰效果不好的可能原因有哪些?
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云梦
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1)感染效率:感染效率较低也会影响病毒的效果;
2)qPCR的引物设计:推荐qPCR的引物设计在靶点的两侧,siRNA介导的基因敲低是由RISC介导的靶基因的切割导致mRNA的降解,由于切割和降解可能具有不同的时间点,因此同侧的qPCR引物可能导致假阴性。
3)检测时间点:慢病毒需要转染72-96 h后才有好的表达效果,所以最早是72h开始检测mRNA水平的变化,通常是瞬转筛选出有效序列后再进行稳筛,因为不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性,有些区域易发生重组或者丢失,从而使稳转株筛选后出现丢失的现象,或者有些基因受到基因调控比较严格,不适合稳筛,稳筛后出现基因回调导致稳筛效果不好。
4)本底表达量较低(目的基因和内参CT值大于11),这里基因比较难敲降,一般建议更换细胞。
5)病毒由于保存不当或者反复冻融导致病毒失活。
6)干扰靶点不合适。
7)基因本身不适合做敲低,需要更换方法做敲除。