做免疫沉淀(IP)实验时,最后沉淀下来的目的蛋白量较低,一般是什么原因导致的?有什么建议吗?

By 梧桐树下 at 28 天前 • 0 人收藏 • 84 人看过


1 个回复 | 最后更新于 25 天前
25 天前   # 1

IP拉下来的目的蛋白量较少主要可能是三个原因:①可能是IP抗体的亲和力不足;②另一个原因可能是目的蛋白本身的表达量较低;③裂解细胞时蛋白被降解。如果是抗体的问题,就需要更换新抗体了,对于新抗体可以先测试亲和性和特异性,评估效果好再继续用于正式实验。如果是蛋白本身表达量低,可以通过外源性过表达的方式来提高表达水平;如果是遇到目的蛋白没有合适的抗体,还可以融合表达如3×flag之类的蛋白标签,借助蛋白标签的抗体进行免疫沉淀。此外,在裂解细胞的同时加入蛋白酶抑制剂,可以防止蛋白降解的情况。

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