带荧光标记的病毒做石蜡切片会显色吗？
冰冻切片发现背景很高,出现许多异常明亮的亮点是怎么回事？
AAV可以感染细胞吗？
1.确定使用的是空白细胞且细胞本身不带有puro抗性；
2.提高浓度再试试看；
3.确定所使用的puro未失效，可以更换不同批次的puro再摸索试试。
基因表达：启动子+基因 CDS——转录成 mRNA——翻译成蛋白
T2A 连接两个基因时，两个基因连接成为一个 ORF（开放阅读框），转录为一条 mRNA， 翻译成一个融合蛋白（由自裂解肽 T2A 连接），这个融合蛋白会被识别 T2A 的蛋白酶切成两个蛋白。所以这两个蛋白的摩尔比理论上是1:1。
缺点：T2A 是一个大约 23 个氨基酸的多肽。切割后前后蛋白会带有 T2A 残基。 T2A 连接时
可以用无缝克隆试剂盒来做，不过拼接效率会随着拼接片段的数量增加或者拼接片段长度的增加逐渐降低，方便的话也可以先把2个目的片段之间先通过overlap PCR连接起来，再与线性化的载体片段进行无缝克隆。
病毒保存主要是避免反复冻融，使用过程可以一支母液首次冰浴融化后，再做下分装成每次大概需要的量，-80保存，这样可以减少多次反复冻融。（注：慢病毒4℃保存一周，-80℃保存如若超过6个月建议重新测滴度，或先感染细胞预实验看看效果。）
为什么我的细胞感染慢病毒之后状态变差了
我想构建一个稳转株，这对细胞类型有要求吗？
为什么同一个siRNA在一种细胞中敲低效率很明显，换成另一种细胞就没有敲低了呢？
不是的，PURO是真核抗性，氨苄是原核抗性。
真核抗性：Puro（嘌呤霉素）、BSD（杀稻瘟菌素）、G418（新霉素）、hygromycin
（潮霉素）等，表达后阳性细胞含抗性基因，用于细胞筛选、稳转株构建等。
原核抗性：氨苄（amp）、卡那（kana）等，用于阳性原核细胞（大肠杆菌）
及其载体质粒扩增。
纯化腺病毒注射动物后3-4天就可以取材检测了，一般动物体内维持表达1-3周左右，如果实验周期1个月建议在2周左右复注射1次。
嘌呤霉素筛选后，后续培养我会把浓度减半进行维持培养；但比如raw264.7这种比较容易分化的细胞，我会隔两代加嘌呤霉素杀一下。可以参考下。
mimics和质粒同时转染我做过，它们2个一起配置1个转染体系转染细胞；或者分开分别配置各自的转染体系，也就是配置2个转染体系分别转染细胞也可以的，不过也看细胞敏感与否。
抗支原体试剂和去黑胶虫试剂如何使用？两种试剂可以一起使用吗？
慢病毒（Lentivirus）载体转染时荧光很亮，但是包装成病毒并感染目的细胞后，荧光很弱，是什么原因？我的目的基因是不是就没有表达？
AAV（Adeno-associated virus，腺相关病毒）载体上带什么荧光标签可以进行活体成像观察
如何筛选稳定株
一般来说，其实病毒转染细胞是一个比较快的过程，几个小时已经完成了大部分的感染；这个时候要去看细胞状态，如果细胞状态好可以适当的延长感染时间直至过夜来进一步提高转染效率；如果细胞状态不太好，可以早点换液。但是如果用了无血清或者低血清的培养基，最好4小时左右就补充含血清的培液或者结合细胞状态考虑是否直接换液。
T2A连接的话，前面的基因A不需要加终止密码子；IRES连接的话，前面的基因A需要加终止密码子。
T2A连接是会先翻译好一条蛋白链，之后在2A肽的位置断裂开来，既然是一条蛋白链，那肯定是不能有终止密码子的，所以要去掉基因A的终止密码子加上 2A 肽序列再加上基因B即可。
IRES是核糖体进入位点，作为额外的核糖体募集位点起作用，允许翻译起始发生在除了翻译起始位点之外的 mRNA 内部区域。IRES连接的话转录的是一条mRNA ，但是翻译的时候由于IRES位点引入核糖体，两个基因分别有自己的起始密码子和终止密码子，可以同时翻
一般放在蛋白C端的比较多。理论上其实N端和C端都是可以放的，只不过蛋白质N端一般会有一些信号肽和重要的功能结构域，放N端对蛋白功能影响可能会比较大，如果有信号肽的话随着信号肽后续被剪切，WB可能会杂不到标签信号，所以一般放在C端比较多。当然具体想放哪段可以结合实验具体需求和目的蛋白本身来具体安排设计即可。
建议可以看下细胞中该目的基因的本底水平如何（目的基因ct值和内参ct值比较），一般目的基因本底水平较低的话，是会出现过表达效果很好，qpcr检测上调倍数达到上万倍的情况的；同时也可以重复下实验再次验证下。
构建带荧光标记的lncRNA过表达载体，用2A肽还是IRES分隔表达？
AAV（Adeno-associated virus，AAV）感染小鼠全脑需要注射在脑子的什么部位呢？
CCRF-CEM用慢病毒（lentivirus,LV）感染效率低，看不到荧光怎么办？
为什么甘油菌加到LB液体培养基里摇不浑？
双荧光素酶实验中报告基因和内参基因质粒共转染的比例是怎样的？