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最后活动于2024-01-23
创建了主题  › 为什么在RNA的提取时。RNA总量会很低?

为什么在RNA的提取时。RNA总量会很低?

«  2024-01-23
创建了主题  › 为什么制SDS-PAGE胶的时候总是漏胶?

为什么制SDS-PAGE胶的时候总是漏胶?

«  2024-01-23
创建了主题  › Co-IP之后的Wb结果中,50kDa和25kDa那里总是有杂带怎么办?

Co-IP之后的Wb结果中,50kDa和25kDa那里总是有杂带怎么办?

«  2024-01-23
创建了主题  › 悬浮细胞怎么提高病毒感染效率?

悬浮细胞怎么提高病毒感染效率?

«  2024-01-23
回复了主题  › 腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的包装容量有多大?

AAV的包装容量(两个ITR之间的片段大小)通常不能超过4.5Kb,除掉启动子、EGFP标记、转录终止信号polyA等元件之外,外源基因的容量能力一般在2kb以下。

«  2024-01-02
回复了主题  › 有没有什么办法可以提高腺病毒(adenovirus,Ad)对细胞的感染效率?

腺病毒对细胞的感染效率受多个因素影响,如病毒活性、细胞自身的状态、MOI值、感染时
间等。
 ① 病毒活性:解冻病毒一定要在冰上进行,尽量避免反复冻融;-80℃保存半年以上需要重新测滴度。
 ② 目的细胞:先进行预实验测试,看病毒载体是否合适感染目的细胞;对于悬浮细胞,可采用平角离心感染的方法;也可以减少病毒感染时的体积,从而提升感染的效率。
 ③ MOI值:进行MOI梯度摸索实验,找出最优的MOI浓度。
 ④ 感染时间,腺病毒一般在感染后8-16h换液,太早换液会导致

«  2024-01-02
回复了主题  › 我的过表达序列有几个氨基酸位点的同义突变,影响qpcr检测过表达效果么?

引物别设计在突变位点处,或者qpcr产物范围避开同义突变位点,一般对于qpcr检测没什么太大影响的。

«  2024-01-02
回复了主题  › circRNA过表达慢病毒这个需要加flag蛋白标签吗?

circRNA是非编码蛋白,不产生蛋白质,不需要加蛋白标签(如flag,HA,His等),蛋白标签是蛋白层面的,而非编码RNA不翻译表达蛋白;当然如果是研究circRNA编码翻译功能的话,一般是会加蛋白标签便于后续检测。

«  2024-01-02
«  2023-12-20
创建了主题  › 我想干扰敲低一个miRNA,有什么方法吗?

我想干扰敲低一个miRNA,有什么方法吗?

«  2023-12-20
创建了主题  › 转染siRNA之后没有干扰效率是怎么回事?

转染siRNA之后没有干扰效率是怎么回事?

«  2023-12-20
创建了主题  › 我把siRNA的浓度加大了为什么敲低效率反而降低了?

我把siRNA的浓度加大了为什么敲低效率反而降低了?

«  2023-12-20
回复了主题  › 我做敲低,mRNA有降低,为何蛋白的抑制没有mRNA那么明显呢?甚至有时候遇到mrna降低很明显,蛋白却没有降低。

我觉得可能有以下几个原因:
①有些蛋白半衰期长,即使干扰也不一定能被很块降低;②部分蛋白在胞内的翻译有一定效率,干扰降低mRNA,细胞可能进一步提高翻译的效率,导致蛋白受的的影响没有mRNA那么直接;③蛋白在胞内有一定的代谢率,且是可变的,当表达减少,胞内蛋白降解效率也可能反向调节。

«  2023-12-06
回复了主题  › 我做敲低,siRNA下调效果很好,但是包装成shRNA病毒后,下调效果变差了,这是为什么呢?

siRNA和shRNA在结构上是不一样的,siRNA是化学合成的,分子较小,转染效率可以的情况下,进入细胞的分子量特别多,且不需要经过剪切加工就可以和靶点结合,干扰效率高。
shRNA是将干扰片段克隆到DNA上,经过病毒整合(慢病毒)或非整合(腺病毒,腺相关病毒)进入到细胞后,转录形成发夹RNA,再经过一系列酶的剪切加工,才形成可以和靶点结合的干扰RNA。
这个过程中因为拷贝数低(如慢病毒需要整合基因组),转录加工过程复杂,会导致干扰效果可能不如siRNA理想。

«  2023-12-06
回复了主题  › 目的基因融合荧光,会因为担心融合荧光影响目的蛋白功能在目的基因和荧光中间加一个linker吗?

一般可以考虑加个柔性Linker(GGGGS)n,让目的蛋白和荧光蛋白之间相对更独立。

«  2023-12-06
回复了主题  › 慢病毒做的敲低稳转细胞株的复苏传代操作和正常细胞有什么区别吗?

慢病毒稳转株和正常细胞的复苏传代以及培养没什么区别,只是有抗性的话可以抗性浓度减半维持培养,或者每隔一代抗性筛选一次也行。

«  2023-12-06
创建了主题  › 双荧光素酶实验中报告基因和内参基因质粒共转染的比例是怎样的?

双荧光素酶实验中报告基因和内参基因质粒共转染的比例是怎样的?

«  2023-11-21
创建了主题  › 带荧光标记的病毒做石蜡切片会显色吗?

带荧光标记的病毒做石蜡切片会显色吗?

«  2023-11-21
创建了主题  › 冰冻切片发现背景很高,出现许多异常明亮的亮点是怎么回事?

冰冻切片发现背景很高,出现许多异常明亮的亮点是怎么回事?

«  2023-11-21
创建了主题  › AAV可以感染细胞吗?

AAV可以感染细胞吗?

«  2023-11-21
回复了主题  › 我用嘌呤霉素(puromycin)摸索细胞适合的浓度,但是用到10ug/ml的浓度48小时仍杀不死空白细胞是什么原因呢?

1.确定使用的是空白细胞且细胞本身不带有puro抗性;
2.提高浓度再试试看;
3.确定所使用的puro未失效,可以更换不同批次的puro再摸索试试。

«  2023-11-02
回复了主题  › 一个启动子启动两个基因表达时,T2A连接和IRES连接有什么区别?

基因表达:启动子+基因 CDS——转录成 mRNA——翻译成蛋白

T2A 连接两个基因时,两个基因连接成为一个 ORF(开放阅读框),转录为一条 mRNA, 翻译成一个融合蛋白(由自裂解肽 T2A 连接),这个融合蛋白会被识别 T2A 的蛋白酶切成两个蛋白。所以这两个蛋白的摩尔比理论上是1:1。
缺点:T2A 是一个大约 23 个氨基酸的多肽。切割后前后蛋白会带有 T2A 残基。 T2A 连接时

«  2023-11-02
回复了主题  › 我有2个目的片段要连到载体上,可以直接用无缝克隆试剂盒来做吗?

可以用无缝克隆试剂盒来做,不过拼接效率会随着拼接片段的数量增加或者拼接片段长度的增加逐渐降低,方便的话也可以先把2个目的片段之间先通过overlap PCR连接起来,再与线性化的载体片段进行无缝克隆。

«  2023-11-02
回复了主题  › 慢病毒使用完就需要放-80℃吗?

病毒保存主要是避免反复冻融,使用过程可以一支母液首次冰浴融化后,再做下分装成每次大概需要的量,-80保存,这样可以减少多次反复冻融。(注:慢病毒4℃保存一周,-80℃保存如若超过6个月建议重新测滴度,或先感染细胞预实验看看效果。)

«  2023-11-02
创建了主题  › 为什么我的细胞感染慢病毒之后状态变差了

为什么我的细胞感染慢病毒之后状态变差了

«  2023-10-18
创建了主题  › 我想构建一个稳转株,这对细胞类型有要求吗?

我想构建一个稳转株,这对细胞类型有要求吗?

«  2023-10-18
创建了主题  › 细胞污染了怎么处理?


«  2023-10-18
创建了主题  › 为什么同一个siRNA在一种细胞中敲低效率很明显,换成另一种细胞就没有敲低了呢?

为什么同一个siRNA在一种细胞中敲低效率很明显,换成另一种细胞就没有敲低了呢?

«  2023-10-18
回复了主题  › Puro抗性和氨苄抗性是一回事吗?

不是的,PURO是真核抗性,氨苄是原核抗性。
真核抗性:Puro(嘌呤霉素)、BSD(杀稻瘟菌素)、G418(新霉素)、hygromycin
(潮霉素)等,表达后阳性细胞含抗性基因,用于细胞筛选、稳转株构建等。
原核抗性:氨苄(amp)、卡那(kana)等,用于阳性原核细胞(大肠杆菌)
及其载体质粒扩增。

«  2023-09-27
回复了主题  › 纯化腺病毒注射动物后多久表达呀?如果我的实验周期1个月,注射1次可以吗?

纯化腺病毒注射动物后3-4天就可以取材检测了,一般动物体内维持表达1-3周左右,如果实验周期1个月建议在2周左右复注射1次。

«  2023-09-27