小恒学术问答 » 落落
落落

用户名:落落

注册于:2023-03-28

主题数: 25     回贴数: 20

网站:

介绍:

最后活动于2023-10-26
回复了主题  › 脂质体转染细胞的时候为什么不能用含血清的培养基配制转染试剂?

因为血清中含有大量的蛋白质,带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体/阳离子聚合物对核酸的吸附,最终影响转染效率。

«  2023-10-13
回复了主题  › 用Cas9和gRNA分开的慢病毒(Lentivirus)做敲除细胞系,两个病毒要怎么转染?怎么筛选?

建议两个慢病毒携带不同的抗性,先转cas9慢病毒,筛好稳转株之后再转gRNA慢病毒,再用另一种药物筛稳转就可以了。

«  2023-10-13
回复了主题  › 我想构建带绿色荧光的载体,看到文献有的带GFP,有的带EGFP,GFP和EGFP两种荧光蛋白有什么区别啊?哪个更好?

GFP(代表绿色荧光蛋白)是一种在暴露于蓝光时表现出明亮的绿色荧光的蛋白质,而EGFP(代表增强型绿色荧光蛋白)表现出比GFP更强的荧光。 此外,GFP和EGFP之间的另一个重要区别是GFP是从水母Aequorea victoria分离出来的野生型蛋白质。但是,EGFP是原始野生型的工程变体。GFP和EGFP是两种类型的蛋白质,用作内部发色团。它们不需要任何辅助酶/底物,辅因子或基因产物来展示其颜色。因此,两者都被用作分子生物学中基因表达的报告者。一般认为EGFP的荧光更强些。

«  2023-10-13
回复了主题  › 请问saCas9的gRNA筛选为什么比spCas9的更难?

这是因为saCas9识别的PAM序列要比spCas9的PAM序列长,在基因组中出现的概率更低,相比于spCas9脱靶率要低,其gRNA设计也相对更困难。

«  2023-10-13
«  2023-09-22
«  2023-09-22
回复了主题  › 如果想稳转两个基因到细胞里,有什么可行的方案吗?

可以将两个基因分别包成两个过表达慢病毒(Lentivirus)进行先后的分别感染与筛选,给两个慢病毒分别带上不同的抗性基因和荧光,先感染一个病毒进行筛选,成功之后,再进行下一个基因的感染与筛选,一般就可获得同时过表达两个基因的稳转细胞株。

«  2023-09-15
回复了主题  › 我看了篇大鼠同样基因的文献,里面筛选了一条90%以上干扰效率的靶点,这个基因的大鼠和小鼠CDS序列相似度很高,我可不可以直接用这个序列做小鼠基因的干扰?

不一定有效果。 首先,需要看大鼠干扰靶点序列是否与小鼠基因CDS序列完全匹配,不能完全匹配则干扰效果不佳或者无效果;其次,即使序列完全匹配,大鼠干扰靶点序列由于未经blast,在小鼠中可能会有脱靶效应。

«  2023-09-15
回复了主题  › 针对一个LncRNA设计了几条siRNA做RNAi,但效果都不是很好,可能原因有哪些?

1)LncRNA大部分是定位于细胞核内, RNAi 机制在细胞质效率远高于细胞核,所以实验前最好弄清楚LncRNA的定位,如果定位于核内就不建议选择siRNA,可以考虑设计ASO进行干扰;

2)LncRNA 是具有高度二级结构的RNA,可能影响siRNA 与 lncRNA 的结合;
3)LncRNA 与 DNA 及蛋白形成复合体,同样阻碍 RISC 复合体与 lncRNA 的结合效率;
4)LncRNA 在多种类型细胞或模

«  2023-09-15
回复了主题  › 求助,针对一个基因我合成了三条siRNA,一条NC。相较空白组,NC无显著变化,三条特异性siRNA都出现了不同程度的下调,但!我做的转染试剂的组也出现了显著的下调,那这组数据还能用吗?

从描述来看,就是试剂对照组也出现了显著的下调,这样来看,你这次实验的数据是没有意义的。试剂对照组的结果表明本次实验操作或者转染试剂使用量对细胞的转录产生了影响,因此也无法证明实验组的下调是siRNA导致的特异性下调,所以建议先摸索试剂最佳用量、排除实验操作问题。

一般来说可分析的干扰实验结果应该是试剂对照组和NC组较空白对照均无显著性变化,前者无变化证明实验设计和操作无误,后者则进一步证明是特异性siRNA引起的特异性下调结果,这样实验组的数据方为有效数据,本人经验,仅供参考。

«  2023-09-15
创建了主题  › 做过表达,qPCR显示有过表达,但是WB没有过表达是为什么啊?

做过表达,qPCR显示有过表达,但是WB没有过表达是为什么啊?

«  2023-09-08
创建了主题  › 干扰慢病毒(lentivirus)是根据基因的所有转录本的共同CDS设计的,做完干扰后想做个过表达回补实验,怎么做才能让外源过表达的基因不受干扰序列的影响呢?

干扰慢病毒(lentivirus)是根据基因的所有转录本的共同CDS设计的,做完干扰后想做个过表达回补实验,怎么做才能让外源过表达的基因不受干扰序列的影响呢?

«  2023-09-08
创建了主题  › 我看做miRNA和靶基因结合还可以用自由能预测,如果targetscan预测分数很低但是自由能预测结果还不错,以哪个为准呢?

我看做miRNA和靶基因结合还可以用自由能预测,如果targetscan预测分数很低但是自由能预测结果还不错,以哪个为准呢?

«  2023-09-08
创建了主题  › 我买了一个Cas9的慢病毒(lentivirus)穿梭质粒,打算自己包慢病毒,可以把这个质粒直接转到细胞里先验证下切割活性吗?

我买了一个Cas9的慢病毒(lentivirus)穿梭质粒,打算自己包慢病毒,可以把这个质粒直接转到细胞里先验证下切割活性吗?

«  2023-09-08
回复了主题  › 我做慢病毒包装的时候,包装质粒转染时荧光很亮,但是包装成病毒并感染目的细胞后,荧光很弱,这种是什么原因,是不是表示目的基因表达效率也不高?

可能原因比较多:1.病毒包装不成功;2.滴度不够,可能病毒尚未从细胞中释放出来,可以试着将细胞裂解一下然后收集病毒;3.调整MOI根据细胞类型适合调整加入的病毒量等
荧光只是观察病毒感染效果的一个辅助方式,荧光强弱不代表目的基因的表达量高低,基因表达水平需要通过基因表达水平需要通过qPCR或者WB来鉴定。

«  2023-08-31
回复了主题  › microRNA做干扰一般怎么检测?也是用qPCR检测microRNA的表达量吗?

一般是通过microRNA靶基因的表达情况判断microRNA的干扰是否有效。一般采用antago或sponge进行microRNA干扰,是利用antago或sponge与靶基因mRNA竞争性去结合microRNA,从而达到干扰microRNA功能的作用,microRNA并不会降解且仍存在于细胞中,所以用qPCR检测其表达量可能不会有变化,无法判断干扰效果。

«  2023-08-31
回复了主题  › 感染小鼠肠道用腹腔注射可以吗?可以的话,大概要用多少腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)呢?

腹腔注射小鼠肠道AAV用量一般在150-200ul/只,但是感染效果不是特别理想,如果实验室有条件建议用肠系膜动脉注射,具体操作和用量可以参考这篇文章→

«  2023-08-31
回复了主题  › 我想在细胞中同时表达两种蛋白,做了两个腺病毒(adenovirus,ADV),可以同时感染吗?moi怎么调整呢?我之前摸索的两个腺病毒的最佳moi都是100。

可以同时感染,如果腺病毒毒性比较小,两个可以都用moi=100感染。如果细胞比较敏感,也可以考虑moi减半再复感染。

«  2023-08-31
回复了主题  › 我想把目的基因和荧光蛋白放一起做融合蛋白,是不是直接把荧光蛋白的序列接在目的基因后面就行了?中间需要加什么元件吗?

可以考虑中间用linker链接,在一定程度上可以分离两个连接的蛋白,避免它们相互作用,进而避免影响融合蛋白的稳定性或者生物活性。

«  2023-08-24
回复了主题  › 用siRNA做基因干扰,但是si-NC也有敲低,是怎么回事呢?

这个最好能结合原始数据分析。你有做单转转染试剂的对照组吗?看看是不是转染试剂的影响。也有可能是目的细胞比较敏感,可以换个细胞试试,如果还是出现这种情况有可能是阴性对照比较意外地结合上,需要换个si-NC。

«  2023-08-24
回复了主题  › 做RNAi实验,请问什么是干扰NC 对照?什么是乱序对照?

干扰NC 对照序列只是一段无义序列,理论上不会靶向任何基因,可用作通用对照,一般可以满足大部分干扰实验的要求。乱序对照是将目的干扰序列打乱而得到的,即一条目的序列对应一条乱序对照,因而又称为严格对照。

«  2023-08-24
回复了主题  › 用来做活体成像的腺相关病毒(AAV),是不是一定得用Luc?Zsgreen可以吗?

可以,但效果一般没有Luc好。类似ZsGreen、GFP或RFP这类荧光蛋白通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。虽然荧光信号远远强于生物发光,但非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于Luc的生物发光。 通俗来讲就是ZsGreen做活体成像最后的结果会产生比较高的背景,也就是生物自发荧光与ZsGreen荧光信号混杂,导致灵敏性低。活体成像首选是Luc。

«  2023-08-24
创建了主题  › 用CRISPR/Cas9做基因敲除,定制的慢病毒(lentivirus),分了两个载体,一个Cas9载体和一个gRNA载体。之前用空载慢病毒摸索过目的细胞的最佳moi,是50,两个病毒载体都用moi=50感染目的细胞吗?

用CRISPR/Cas9做基因敲除,定制的慢病毒(lentivirus),分了两个载体,一个Cas9载体和一个gRNA载体。之前用空载慢病毒摸索过目的细胞的最佳moi,是50,两个病毒载体都用moi=50感染目的细胞吗?

«  2023-08-17