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回复了主题  › 为什么不能用质粒来构建基因稳定表达细胞株呀？ 质粒转染细胞进行基因表达，其整合是非同源重组随机整合，几率非常低，且这些转染条 件下发生的整合多发生在转录非活跃区或者重复序列区，导致外源片段表达效率低，同时 这些整合常常不稳定，随着传代次数的增加，即使在有压力选择的情况下也容易发生丢失。

回复了主题  › 慢病毒（lentivirus, LV）、腺病毒（adenovirus, AD）、腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）都可以进行再次扩增吗？ 不是所有的都能再次扩增，只有腺病毒可以用293A细胞进行再次扩增，而慢病毒、腺相关病毒都需要进行再次包装，不能进行直接扩增。

回复了主题  › 进行一个基因的过表达，添加 flag 标签的目的是什么呢？ 对于带3FLAG标签的蛋白用 Flag 抗体进行蛋白免疫印迹（western blot，WB）检测时，结果会是一条外源表达的条带；如果用目的抗体去检测，结果可能会是两个条带（内源蛋白+外源过表达蛋白），外源过表达条带在内源条带的上方，但是很多时候两条带会在一起形成一条比较粗的条带。

回复了主题  › 我想做小鼠活体成像，可以用荧光蛋白来做吗？ 活体成像技术（optical in vivo imaging）目前主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种方法。原理：生物发光法是基于荧光素酶能催化底物化学发光的原理，将荧光素酶底物荧光素如 D-Luciferin 等注射入体内进行化学发光反应。荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光，如 EGFP，RFP等。但是由于生物体自发荧光干扰和荧光穿透问题，所以 GFP 等荧光蛋白适合做皮下等浅层组织的活体成像。目前，95%以上的活体实验都是采用荧光素酶 lucifera

回复了主题  › 进行一个基因的过表达，添加 flag 标签的目的是什么呢？ 蛋白标签（protein tag）是指利用 DNA 体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。比较常用的Flag标签，一般用3FLAG（分子量 2.64kd，一个氨基酸的平均分子量是 0.110KDa）的比较多，主要是方便在 WB 检测表达情况时可以用 Flag抗体去检测外源蛋白过表达的情况，也可以方便的用于蛋白免疫沉淀实验（Immunoprecipitation, IP）。

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回复了主题  › 慢病毒感染细胞，使用抗性（比如嘌呤霉素puro）筛选后，后续培养细胞需要继续使用抗性维持培养吗？ 仍旧需要使用抗性进行维持培养的，维持培养可以将抗性浓度减半（相对于筛选时的浓度）

回复了主题  › QPCR 实验中 Ct 值偏大（如 Ct 值＞30）是为什么？ 1）第一个可能是模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct 值能否成相应倍数减少。2）第二个可能是 qPCR 整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。3）第三个可能是扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或通过优化引物，扩增产物长度最好不超过 300bp。4）第四个可能是体系中存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

回复了主题  › 萤火虫荧光素酶Fluc和海肾荧光素酶Rluc与底物反应后，检测波长分别是多少呢？ fluc萤火虫荧光素酶与底物反应后的检测波长是在560nm左右，rluc海肾荧光素酶与底物反应后的检测波长在460nm左右。

回复了主题  › 针对基因编码区CDS设计的干扰序列进行慢病毒包装后做细胞基因干扰，后续进行基因的过表达回补实验要怎么做呀？ 后续进行基因过表达回补的话，一般就是在目的基因编码区CDS中针对干扰序列对应的位置进行同义突变再进行回补；如果干扰序列设计在非翻译区（5UTR或3UTR）则过表达回补就不用考虑做同义突变啦，直接过表达野生型编码区CDS序列即可。

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回复了主题  › 腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）在体注射感染动物，一般多久开始表达呀，可以维持表达多长时间呢？ 这个结合我的经验一般AAV是注射后2周是表达起峰，3周高表达，4周稳定表达；一般在体表达维持时间是3-6个月，也要结合组织的代谢情况具体分析的，实验周期长的话，一般会在一个半月到两个月复注射一次

回复了主题  › Tet-on的慢病毒（lentivirus, LV）感染细胞，一般四环素（doxycycline）加进去多久后开始起效呢？ 一般四环素加进去就可以起效，检测RNA或者蛋白表达的话我一般是加入四环素后48-72h检测表达的。

回复了主题  › 过表达和干扰的启动子有什么区别？ 过表达用的是 II 型启动子，是依赖 II 型 RNA 聚合酶的启动子，可以启动长的片段，比如 CMV、EF1A ，依赖 PolyA 进行转录终止；干扰用的是 III 型启动子，是依赖Ⅲ型 RNA 聚合酶的启动子，比如 U6，H1启动子，聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时,它指导的转录就会终止。

回复了主题  › 用表达gRNA和cas9的质粒做瞬时转染可以达到基因稳定敲除的目的吗？ 可以这样做的，cas9和gRNA表达后会对基因组进行编辑，基因组被编辑后就是稳定存在的，之后可以进行单克隆培养，筛选基因敲除单克隆

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回复了主题  › 某种细胞的慢病毒感染复数MOI的摸索，需要干扰对照病毒和表达干扰靶点的病毒都去做摸索吗？ 不需要的，只要用对照病毒摸索出这个细胞合适的MOI就行，我一般用96孔板摸索，节省病毒。