创建了主题  › 腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）感染肝细胞的话，需要用什么浓度，大概可以维持表达多长时间呢？ 腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）感染肝细胞的话，需要用什么浓度，大概可以维持表达多长时间呢？

创建了主题  › 慢病毒（lentivirus , LV）感染细胞时，细胞接种量是多少比较好呢？ 慢病毒（lentivirus , LV）感染细胞时，细胞接种量是多少比较好呢？

创建了主题  › 慢病毒（lentivirus , LV）如何稀释？ 慢病毒（lentivirus , LV）如何稀释？

回复了主题  › 为什么过表达慢病毒质粒转染 293T 的荧光很强而用慢病毒感染 293T 的荧光反而弱呢？ 首先， 性质差异； 转染是带有目的基因的质粒 DNA 在转染试剂作用下强行进入细胞的过程， 而感染是慢病毒颗粒和目的细胞相互作用， 通过受体结合、 细胞吞噬等过程， 介导慢病毒基因组进入到细胞中；其次， 表达环节不同； 转染的 DNA 进入细胞后， 转录为 mRNA， 之后就可以翻译了；而慢病毒是 RNA 逆转录病毒， 感染细胞后， 先逆转录为 DNA， 再转录为 mRNA， 然后才是翻译 

回复了主题  › SaCas9 和 spCas9 区别， 我们的慢病毒， 腺病毒， 腺相关病毒分别用的是哪种 Cas9？ SaCas9 来自金黄色葡萄球菌， 基因长度由经典的 spCas9 的 4400bp 缩短为 3300bp。SaCas9 识别的 PAM 区为 NNGRRT（NNGAAT,NNGAGT,NNGGAT,NNGGGT） ， NNGRRN。 ， 对于 sgRNA的长度， 一般应为 21 或者 22bp， SpCas9 识别的 PAM 区为 NGG， 对于 sgRNA 的长度， 一般应为 20bp.慢病毒和腺病毒用的是 SpCas9， 腺相关病毒用的是 SaCas9。

回复了主题  › 我的基因和GFP 融合，用慢病毒感染细胞后荧光比较弱，可能是哪些因素造成的呀？ 一般是以下原因：（ 1） 常规原因， 包括病毒滴度、 细胞感染难易程度等（ 2） 目的基因大小， GFP 蛋白水平的表达会受到目的基因的大小而变化， 通常接入的基因越大， GFP 荧光越弱（ 3） 目的基因的功能的影响 GFP 的表达。 对于核定位、 膜定位、 分泌类的蛋白与 GFP融合表达， GFP 观察荧光时会受到目的蛋白的功能的影响； 通常在同等基因大小条件下， 无定位趋势的目的基因和GFP 融合蛋白的荧光强度要远高与具有定位趋势的基因的表达。 

回复了主题  › 为什么我的片子在观察荧光时要曝光很长时间才能观察到荧光？ 可能是显微镜的汞灯使用时间长导致，可以通过对照排除，若对照较亮可以排除显微镜的问题；培养基的PH值低，看培养基是否发黄，PH值较低会导致绿色荧光淬灭；目的基因插入到病毒载体后，荧光强度是会相对较弱一些，可以增加曝光时间。

回复了主题  › 我用 siRNA 做干扰，验证了明明有效果，为什么把这个序列包装成慢病毒做干扰效果不好了呢？ siRNA 是化学合成的，不需要经过剪切就可以直接跟靶点结合进行作用的，效率比较高； shRNA 是一个构建到质粒上或者包成病毒，需要转录形成发夹结构的 shRNA，经过酶切，才 能跟靶点结合，这个过程可能因为拷贝数低，转录过程复杂导致干扰效果不理想。

回复了主题  › 为什么做WB用标签抗体检测有过表达，但是用目的抗体检测没有过表达？ 这种情况有挺多可能的，比如：1、两种抗体灵敏度；2、过表达量被本底掩盖，基因在细胞本身有较高的内源性表达量，过表达后检测到的浓度之比本底的高一点，所以并不明显，此时如果上样量再有点差异就会被掩盖，而标签抗体是有或者无的区别，因此较明显；3、这个基因存在多个转录本，目的抗体只能检测其中某一种或某几种表达形式，可以查看一下抗体的抗原表位或者咨询卖这个抗体的公司。

回复了主题  › 细胞应该在什么时候进行传代？ 对于转化细胞来说，可在生长至完全汇合后进行传代，细胞生长大都不宜过密，对于存在接触抑制的细胞，在汇合度80%可传代，否则易引起细胞老化，或生长缓慢需要较长时间才能恢复正常。

回复了主题  › 使用mRFP-GFP-LC3自噬双标病毒做细胞爬片的话，感染之后，还需要什么操作再去荧光显微镜下观察呀？ 4%多聚甲醛固定，用防淬灭的固定剂封片，然后直接去荧光显微镜下观察拍照就行。

回复了主题  › 我的细胞生长不均匀怎么办？ 那就应该及时传代来保持细胞状态了。然后传代的时候多次轻柔吹打消化，用8字法等方法摇匀，传代之后就不要随便移动培养皿了。

创建了主题  › 用于动物体内实验的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV) ，是否需要纯化与浓缩? 用于动物体内实验的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV) ，是否需要纯化与浓缩?

创建了主题  › 腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)进入宿主细胞之后，其基因组会整合到宿主细胞基因组中吗? 腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)进入宿主细胞之后，其基因组会整合到宿主细胞基因组中吗?

创建了主题  › 常用的病毒滴度的单位有哪些呢? 常用的病毒滴度的单位有哪些呢?

回复了主题  › 之前做cirRNA跟miRNA结合预测到了一些miRNA，我要怎么查到这些miRNA的信息啊？ 这个一般就是在mirbase上查，ncbi上也能看到大部分信息，但是没mirbase全。我记得genecard上也能看人的miRNA来着。

回复了主题  › 我想给人脐带间充质干细胞做永生化，还要敲入一个基因做过表达稳转株，这个要怎么弄比较好啊。 应该得先永生化，转SV40T跟htert，永生化成功之后再慢病毒过表达目的基因。这个还得选好不同的筛选抗性或荧光基因，感觉还挺复杂的。

回复了主题  › 提出来的RNA里有有线性RNA和circRNA，想去掉线性RNA，去检测样本里的circRNA，可以有方法做得到么？ 这个用RNA外切酶，RNase R去线性化就行了，我看别的实验室就是这么做的，应该是个比较常用的方法

创建了主题  › 体外细胞实验为什么很少见到有用腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）病毒做的呢？ 体外细胞实验为什么很少见到有用腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）病毒做的呢？

创建了主题  › 腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）是如何达到体内特异性表达的呢？ 腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）是如何达到体内特异性表达的呢？

创建了主题  › 腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）的安全性怎么样？ 腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）的安全性怎么样？

创建了主题  › 用于动物注射的siRNA需要做哪种修饰呢？ 用于动物注射的siRNA需要做哪种修饰呢？

回复了主题  › 我自己做启动子和转录因子的双荧光素酶实验，检测到的值都只有几十，这正常吗？ 这应该是不太正常呢，我们测量的基本是几万到几百万的都有，可能是质粒没转染进去，细胞的状态差会影响转染效率，也有可能是实验检测试剂盒的问题，或者检测机器没有设置好，需要逐一排查一下。

回复了主题  › 做启动子和转录因子的双荧光素酶实验，必须要转内参质粒吗？内参质粒是哪个呢？ 必须要转内参的，这个内参是为了平衡细胞数量、转染效率等误差，这个实验中，内参质粒是phRL-TK

创建了主题  › 请问3代的慢病毒载体可以使用2代的慢病毒包装系统来包装吗？ 请问3代的慢病毒载体可以使用2代的慢病毒包装系统来包装吗？

创建了主题  › 加入慢病毒病毒后，细胞死亡很厉害，该如何处理？ 加入慢病毒病毒后，细胞死亡很厉害，该如何处理？

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