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Biothinker

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注册于:2022-09-18

主题数: 48     回贴数: 15

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最后活动于2022-09-18
创建了主题  › 腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)感染肝细胞的话,需要用什么浓度,大概可以维持表达多长时间呢? 腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)感染肝细胞的话,需要用什么浓度,大概可以维持表达多长时间呢?
«  2022-08-16
创建了主题  › 慢病毒(lentivirus , LV)感染细胞时,细胞接种量是多少比较好呢? 慢病毒(lentivirus , LV)感染细胞时,细胞接种量是多少比较好呢?
«  2022-08-16
创建了主题  › 慢病毒(lentivirus , LV)如何稀释? 慢病毒(lentivirus , LV)如何稀释?
«  2022-08-16
回复了主题  › 为什么过表达慢病毒质粒转染 293T 的荧光很强而用慢病毒感染 293T 的荧光反而弱呢? 首先, 性质差异; 转染是带有目的基因的质粒 DNA 在转染试剂作用下强行进入细胞的过程, 而感染是慢病毒颗粒和目的细胞相互作用, 通过受体结合、 细胞吞噬等过程, 介导慢病毒基因组进入到细胞中;其次, 表达环节不同; 转染的 DNA 进入细胞后, 转录为 mRNA, 之后就可以翻译了;而慢病毒是 RNA 逆转录病毒, 感染细胞后, 先逆转录为 DNA, 再转录为 mRNA, 然后才是翻译 
«  2022-08-15
回复了主题  › SaCas9 和 spCas9 区别, 我们的慢病毒, 腺病毒, 腺相关病毒分别用的是哪种 Cas9? SaCas9 来自金黄色葡萄球菌, 基因长度由经典的 spCas9 的 4400bp 缩短为 3300bp。SaCas9 识别的 PAM 区为 NNGRRT(NNGAAT,NNGAGT,NNGGAT,NNGGGT) , NNGRRN。 , 对于 sgRNA的长度, 一般应为 21 或者 22bp, SpCas9 识别的 PAM 区为 NGG, 对于 sgRNA 的长度, 一般应为 20bp.慢病毒和腺病毒用的是 SpCas9, 腺相关病毒用的是 SaCas9。
«  2022-08-15
回复了主题  › 我的基因和GFP 融合,用慢病毒感染细胞后荧光比较弱,可能是哪些因素造成的呀? 一般是以下原因:( 1) 常规原因, 包括病毒滴度、 细胞感染难易程度等( 2) 目的基因大小, GFP 蛋白水平的表达会受到目的基因的大小而变化, 通常接入的基因越大, GFP 荧光越弱( 3) 目的基因的功能的影响 GFP 的表达。 对于核定位、 膜定位、 分泌类的蛋白与 GFP融合表达, GFP 观察荧光时会受到目的蛋白的功能的影响; 通常在同等基因大小条件下, 无定位趋势的目的基因和GFP 融合蛋白的荧光强度要远高与具有定位趋势的基因的表达。 
«  2022-08-15
回复了主题  › 为什么我的片子在观察荧光时要曝光很长时间才能观察到荧光? 可能是显微镜的汞灯使用时间长导致,可以通过对照排除,若对照较亮可以排除显微镜的问题;培养基的PH值低,看培养基是否发黄,PH值较低会导致绿色荧光淬灭;目的基因插入到病毒载体后,荧光强度是会相对较弱一些,可以增加曝光时间。
«  2022-08-10
回复了主题  › 我用 siRNA 做干扰,验证了明明有效果,为什么把这个序列包装成慢病毒做干扰效果不好了呢? siRNA 是化学合成的,不需要经过剪切就可以直接跟靶点结合进行作用的,效率比较高; shRNA 是一个构建到质粒上或者包成病毒,需要转录形成发夹结构的 shRNA,经过酶切,才 能跟靶点结合,这个过程可能因为拷贝数低,转录过程复杂导致干扰效果不理想。
«  2022-08-10
回复了主题  › 为什么做WB用标签抗体检测有过表达,但是用目的抗体检测没有过表达? 这种情况有挺多可能的,比如:1、两种抗体灵敏度;2、过表达量被本底掩盖,基因在细胞本身有较高的内源性表达量,过表达后检测到的浓度之比本底的高一点,所以并不明显,此时如果上样量再有点差异就会被掩盖,而标签抗体是有或者无的区别,因此较明显;3、这个基因存在多个转录本,目的抗体只能检测其中某一种或某几种表达形式,可以查看一下抗体的抗原表位或者咨询卖这个抗体的公司。
«  2022-08-10
回复了主题  › 细胞应该在什么时候进行传代? 对于转化细胞来说,可在生长至完全汇合后进行传代,细胞生长大都不宜过密,对于存在接触抑制的细胞,在汇合度80%可传代,否则易引起细胞老化,或生长缓慢需要较长时间才能恢复正常。
«  2022-08-10
回复了主题  › 使用mRFP-GFP-LC3自噬双标病毒做细胞爬片的话,感染之后,还需要什么操作再去荧光显微镜下观察呀? 4%多聚甲醛固定,用防淬灭的固定剂封片,然后直接去荧光显微镜下观察拍照就行。
«  2022-08-10
回复了主题  › 我的细胞生长不均匀怎么办? 那就应该及时传代来保持细胞状态了。然后传代的时候多次轻柔吹打消化,用8字法等方法摇匀,传代之后就不要随便移动培养皿了。
«  2022-08-10
创建了主题  › 用于动物体内实验的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV) ,是否需要纯化与浓缩? 用于动物体内实验的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV) ,是否需要纯化与浓缩?
«  2022-08-08
创建了主题  › 腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)进入宿主细胞之后,其基因组会整合到宿主细胞基因组中吗? 腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)进入宿主细胞之后,其基因组会整合到宿主细胞基因组中吗?
«  2022-08-08
创建了主题  › 常用的病毒滴度的单位有哪些呢? 常用的病毒滴度的单位有哪些呢?
«  2022-08-08
回复了主题  › 之前做cirRNA跟miRNA结合预测到了一些miRNA,我要怎么查到这些miRNA的信息啊? 这个一般就是在mirbase上查,ncbi上也能看到大部分信息,但是没mirbase全。我记得genecard上也能看人的miRNA来着。
«  2022-08-03
回复了主题  › 我想给人脐带间充质干细胞做永生化,还要敲入一个基因做过表达稳转株,这个要怎么弄比较好啊。 应该得先永生化,转SV40T跟htert,永生化成功之后再慢病毒过表达目的基因。这个还得选好不同的筛选抗性或荧光基因,感觉还挺复杂的。
«  2022-08-03
回复了主题  › 提出来的RNA里有有线性RNA和circRNA,想去掉线性RNA,去检测样本里的circRNA,可以有方法做得到么? 这个用RNA外切酶,RNase R去线性化就行了,我看别的实验室就是这么做的,应该是个比较常用的方法
«  2022-08-03
创建了主题  › 体外细胞实验为什么很少见到有用腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)病毒做的呢? 体外细胞实验为什么很少见到有用腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)病毒做的呢?
«  2022-08-01
创建了主题  › 腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)是如何达到体内特异性表达的呢? 腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)是如何达到体内特异性表达的呢?
«  2022-08-01
创建了主题  › 腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)的安全性怎么样? 腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)的安全性怎么样?
«  2022-08-01
创建了主题  › 用于动物注射的siRNA需要做哪种修饰呢? 用于动物注射的siRNA需要做哪种修饰呢?
«  2022-07-27
回复了主题  › 我自己做启动子和转录因子的双荧光素酶实验,检测到的值都只有几十,这正常吗? 这应该是不太正常呢,我们测量的基本是几万到几百万的都有,可能是质粒没转染进去,细胞的状态差会影响转染效率,也有可能是实验检测试剂盒的问题,或者检测机器没有设置好,需要逐一排查一下。
«  2022-07-26
回复了主题  › 做启动子和转录因子的双荧光素酶实验,必须要转内参质粒吗?内参质粒是哪个呢? 必须要转内参的,这个内参是为了平衡细胞数量、转染效率等误差,这个实验中,内参质粒是phRL-TK
«  2022-07-26
创建了主题  › 请问3代的慢病毒载体可以使用2代的慢病毒包装系统来包装吗? 请问3代的慢病毒载体可以使用2代的慢病毒包装系统来包装吗?
«  2022-07-25
创建了主题  › 加入慢病毒病毒后,细胞死亡很厉害,该如何处理? 加入慢病毒病毒后,细胞死亡很厉害,该如何处理?
«  2022-07-25
创建了主题  › 为什么过表达基因慢病毒的荧光比对照的荧光弱? 为什么过表达基因慢病毒的荧光比对照的荧光弱?
«  2022-07-20
创建了主题  › 慢病毒感染细胞后,细胞死亡的很多,还出现黑点是什么原因呢? 慢病毒感染细胞后,细胞死亡的很多,还出现黑点是什么原因呢?
«  2022-07-20
创建了主题  › AAV注射小鼠后有20%左右的死亡,应该从哪些地方分析原因? AAV注射小鼠后有20%左右的死亡,应该从哪些地方分析原因?
«  2021-12-09
创建了主题  › 慢病毒感染细胞做过表达,用puromycin筛选7天死亡比较多,是跟我筛选时间过长有关吗?应该筛选多久比较好呢? 慢病毒感染细胞做过表达,用puromycin筛选7天死亡比较多,是跟我筛选时间过长有关吗?应该筛选多久比较好呢?
«  2021-12-09