滴度单位VP、PFU、IFU的区别是什么呢？哪一个能更好反映有活性的病毒数目？

腺病毒（Adenovirus，Ad）为什么需要纯化后用于体内动物实验？

我做慢病毒（lentivirus，LV）包装，但是包装过程293T细胞大量死亡是啥原因呀？

我合成的siRNA中有三种对照：cy3阴性对照、阴性对照和阳性对照，都有啥作用呀？我不太会区分。

可以从以下几个方面改善：1.对于状态差的细胞，第1周用20%的血清帮助复原新细胞；2.减少融化时间，可以在水浴时摇动冻存管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5~0℃）；3.细胞长期冻存时应置于液氮中保存；4.补加细胞因子；5.稀释或去除DMSO。

一般情况下稳转株指的是多克隆细胞系，多克隆细胞系是多个阳性细胞克隆的混合细胞群，每个细胞其外源片段的整合位点不一样，在长期培养过程中容易出现表型不稳定的现象。单克隆细胞株是由单个细胞分裂扩增形成的单一细胞群，可以长期稳定表型。大部分情况下，多克隆细胞系足以保证实验完成，而对于基因表达效率低、细胞难转染等情况以及药物靶点筛选等要求较高的实验，则更建议进行单克隆细胞筛选。

siRNA直接作用于mRNA，因此mRNA水平检测是最直接的指标。很多人认为，mRNA降解的直接结果应该是对应蛋白质含量的下降，因此蛋白水平的检测结果也应该可以作为有效性的检测指标。事实上，很多情况下会出现，mRNA下降水平与蛋白下降水平不对应的现象。其可能原因有：1.与选择的检测时间有关，因mRNA的下降尚未反映在蛋白量的变化上或者未达到足以检测的水平，所以一般建议蛋白和功能检测时间要稍稍推后；2.与蛋白在细胞中的表达情况有关，mRNA的翻译过程非常复杂，细胞内基因的表达总要维持一个平衡，某些蛋白表达量到一定的程度之后，足以维持其细胞功能，将可能暂时“关闭”表达的功能，转录出来的部分m

慢病毒滴度是用于评估转导一定数量靶细胞所需要的病毒数量。

影响慢病毒滴度的决定因素主要有：1.包装细胞，293T细胞作为常用的包装宿主，其健康状态是影响病毒产量的关键因素，用于慢病毒包装的293T细胞的传代数不宜过高，建议使用30代以内的293T细胞；2.转染效率，选择优化后的转染体系和专用转染试剂提高转染效率；3.插入基因片段大小，慢病毒载体容纳外源基因长度的能力有限，超过3kb就会导致包装效率大大降低，而整个质粒过大，也会导致转染效率降低，进而影响最终的滴度；4.收病毒的时机，转染后的第24 h~48 h是慢病毒的生产高峰，可收获第一批慢病毒，在48 h~72 h，滴度下

我最近做了我的目的基因的干扰（knockdown，KD），qpcr检测发现敲低效果非常好，但为啥WB检测蛋白变化不明显呢？

基因干扰用的siRNA，miRNA过表达合成的mimics和miRNA干扰用的inhibitor分别是什么形式的小分子呀？

我用腺病毒（adenovirus，Ad）mt-keima工具监测线粒体自噬情况，我可以对细胞固定后进行成像吗？还是说必须要活细胞成像呢？

我做慢病毒（lentivirus，LV)/腺病毒（adenovirus，Ad）感染细胞，感染结束后进行换液，那换液后需要PBS 清洗（wash）下吗？

Cas9有很多种类型，每种Cas9识别的PAM基序不同，gRNA的序列设计也有所不同，gRNA需要与相应的Cas9配合才能发挥最大作用，例如针对SpCas9设计的gRNA与SaCas9一起使用可能没有编辑效率。所以如果您实验的靶细胞和小鼠的Cas9是同一种Cas9，那么可以将该gRNA包装成AAV，注射Cas9基因小鼠；如果不是同一种Cas9，建议重新设计gRNA进行动物实验。

这是一种硒蛋白，硒半胱氨酸(Sec，U)由UGA密码子编码，一般情况下这个UGA表示翻译终止，但是硒蛋白mRNA的3' UTR包含一个保守的茎环结构，称为Sec插入序列(SECIS)元件，可以将UGA识别为Sec密码子而不是翻译终止信号，所以在过表达硒蛋白时需要将基因的CDS和3' UTR一起构建到载体上，这样就可以正常表达了。

我觉得可以考虑以下原因：
1.荧光易淬灭，注意避光。转染时室内和超净台内不开日光灯（FAM对避光要求更严格）；

2.转染操作要快，操作时间要短，操作完毕后，尽快将培养板放到培养箱。
3.sirna本身有荧光标记，可以在换液前后观察确定是荧光淬灭还是转染效率不够导致的。

FRET的荧光选择有几个基本原则：1.能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；2.能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；3.供体与受体的激发光谱要足够分离。可以选择已知的荧光团对进行FRET实验，例如CFP/YFP、CFP-dsRED、YFP-dsRED、BFP/GFP、GFP-dsRED、FITC-Rhodamine、FITC/Cy3、Alexa488-Alexa555等。

有人知道pcdna3.1+/-质粒（plasmid）中的+、-是什么意思啊，有什么区别？

最近在做慢病毒（lentivirus，LV）转染，那转染后的细胞需要与其它普通细胞分开培养箱放吗？操作台需要分开吗？

我做的基因过表达质粒（plasmid）转染，但是质粒不带荧光，我可以做免疫荧光看转染效率吗？

我的腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）的病毒液从-80℃冰箱拿出来管子上有挂壁，我可以离下心吗?

因为血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能会干扰阳离子脂质体或阳离子聚合物与表面带负电荷的细胞膜的吸附作用从而影响转染效率；双抗一般对真核细胞无毒，但转染是阳离子脂质体实际增加了细胞的通透性，使双抗可以进入细胞，可能会降低细胞的活性，从而导致转染效率低、细胞状态差。所以转染过程一般建议使用无血清、无双抗的基础培养基，转染4-6小时后可换液为完全培养基。

可以先查阅文献，有没有报道过敲除致死或者成功构建敲除株的案例，如果没有相关报道，建议先进行预实验，在cell pool阶段检测敲除效果是否逐渐减弱，进一步筛选单克隆时，鉴定不到两个等位基因都发生移码的单克隆，说明目的基因可能存在敲除致死或影响细胞生长。

融合表达多用于目的蛋白亚细胞定位、蛋白互作等研究，可将目的蛋白基因和荧光蛋白基因融合到同一质粒或病毒载体中，构建融合基因表达载体，并转染至细胞内，表达的融合蛋白能行使目的蛋白的生物学功能，又有荧光蛋白的发光特点。如果不需要进行蛋白定位等实验，荧光可以不与基因融合，此时荧光作为转染效率的指标之一。

isoform对应的是在蛋白水平上的同源异构体，transcript variant指的是RNA水平的转录本，有时不同的variant可能对应一个isoform。

一个基因的多个转录本的产生通常是以下一种原因或者几种原因共同发生导致：选择性剪接；可变启动子；选择性翻译起始；核糖体移位（一种翻译重编码机制，多出现在病毒中）。

选择转录本需要查阅文献，哪个转录本是符合自己研究目的的。实在不知道选择哪个转录本的时候，可以尝试这几种方式：结合uniprot查询经典转录本，选经典转录本进行实验；用不同转录本的NM号和关键词到NCBI上去查，哪个NM号文章多，就用哪个；或者选

进行慢病毒（Lentivirus，Lv）感染，请问如何根据我目的细胞的MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）来确定所需要的慢病毒病毒液体积呀？

有人知道含质粒（plasmid）的菌液使用液体LB培养基进行扩增时，LB中所使用的氨苄青霉素（Ampicillin

我用慢病毒（Lentivirus，Lv）感染细胞后，使用嘌呤霉素（puromycin）成功筛选好稳转株后，还需要继续加嘌呤霉素吗？

我把-20℃冻存的质粒

感染悬浮或半悬浮细胞，可以通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后， 封好口，放入平角离心机后，低速（1200g）离心1 h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由

50kDa和25kDa是抗体的轻重链，如果目的蛋白大小不在50kDa或25kDa附近，可以不用在乎这两杂带，如果目的蛋白大小靠近50kDa或25kDa，可以选择不同种属来源的一抗分别进行免疫沉淀和WB，然后再选择无种属交叉反应的二抗进行WB实验，或者选择特殊的二抗，比如只识别轻链或重链的二抗进行WB实验。