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橘子

用户名:橘子

注册于:2023-02-07

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最后活动于24 小时前
创建了主题  › Puro抗性和氨苄抗性是一回事吗?

Puro抗性和氨苄抗性是一回事吗?


«  24 小时前
创建了主题  › 纯化腺病毒注射动物后多久表达呀?如果我的实验周期1个月,注射1次可以吗?

纯化腺病毒注射动物后多久表达呀?如果我的实验周期1个月,注射1次可以吗?


«  24 小时前
创建了主题  › 我用PURO抗性的慢病毒感染细胞表达后,用嘌呤霉素筛选了感染阳性的细胞,那后续培养还需要加嘌呤霉素吗?

我用PURO抗性的慢病毒感染细胞表达后,用嘌呤霉素筛选了感染阳性的细胞,那后续培养还需要加嘌呤霉素吗?


«  24 小时前
创建了主题  › 我想把miRNA过表达的mimics和另外一个我的质粒一起转染细胞,这个有什么方案吗?

我想把miRNA过表达的mimics和另外一个我的质粒一起转染细胞,这个有什么方案吗?


«  24 小时前
回复了主题  › 如何筛选稳定株

我常用的有两种方法:一种是通过真核细胞抗性药物筛选,例如puro;一种是让细胞带上荧光信号,利用流式细胞仪分选得到荧光信号阳性的细胞。

«  16 天前
回复了主题  › AAV载体上带什么荧光标签可以进行活体成像观察

建议选择生物发光Luc,GFP和RFP等背景太高,灵敏度低,因此不是很推荐。

«  16 天前
回复了主题  › 慢病毒载体转染时荧光很亮,但是包装成病毒并感染目的细胞后,荧光很弱,是什么原因?我的目的基因是不是就没有表达?

(1)病毒包装不成功。
(2)滴度不够。
(3)被感染的细胞不同,其MOI值不同,要根据细胞类型适当调整加入的病毒量。
(4)荧光只是观察病毒感染效果的一个辅助方式,荧光强弱不代表目的基因的表达量高低,基因表达水平需要通过基因表达水平需要通过qPCR或者WB来鉴定。

«  16 天前
回复了主题  › 抗支原体试剂和去黑胶虫试剂如何使用?两种试剂可以一起使用吗?

抗支原体:抑制按照1:1000的比例加到培养基中,预防按1:2000比例加;黑胶虫:按照1:500比例加到培养基中;两个可以同时加。

«  16 天前
创建了主题  › 我用病毒转染细胞之后到底多长时间换液啊?

我用病毒转染细胞之后到底多长时间换液啊?


«  2023-08-29
创建了主题  › 如果我用T2A或IRES连接2个基因进行过表达,比如 基因A—T2A/IRES—基因B,那么我前面的 基因A 需要加终止密码子吗?

如果我用T2A或IRES连接2个基因进行过表达,比如 基因A—T2A/IRES—基因B,那么我前面的 基因A 需要加终止密码子吗?


«  2023-08-29
创建了主题  › Flag/6His/Myc等蛋白标签一般带在蛋白的N端还是C端呀?

Flag/6His/Myc等蛋白标签一般带在蛋白的N端还是C端呀?


«  2023-08-29
创建了主题  › 我用慢病毒感染我的目的细胞进行基因过表达,qpcr检测目的组相对于对照组上调上万倍,这正常吗?

我用慢病毒感染我的目的细胞进行基因过表达,qpcr检测目的组相对于对照组上调上万倍,这正常吗?


«  2023-08-29
回复了主题  › 带荧光标记的lncRNA过表达载体的构建

lncRNA是长链非编码RNA,转录出来的RNA并不会翻译成蛋白质。2A肽是在蛋白水平实现基因的分隔表达,所以不能用于此种载体设计。IRES可在RNA水平实现基因分隔表达,但是转录出来的RNA是荧光蛋白序列、IRES和lncRNA序列的融合,荧光蛋白和IRES序列可能会严重影响lncRNA功能,所以也不建议使用。一般都会选择双启动子载体,分别启动荧光及lncRNA。

«  2023-08-15
回复了主题  › AAV感染全脑小胶质细胞的注射方式

感染全脑我觉得可以考虑用跨血脑屏障血清型BBB的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)进行尾静脉注射;如果要感染全脑小胶质细胞我觉得可以考虑用跨血脑屏障血清型BBB并结合小胶质细胞特异性

«  2023-08-15
回复了主题  › 慢病毒(lentivirus,LV)感染效率低

CCRF-CEM是悬浮细胞,悬浮细胞比较难感染,可以进行以下尝试:
1.添加适量的助转剂;
2.按照说明书进行小体积感染法;
3.延长感染时间,每隔一段时间晃动培养板混匀一次;
4.转染后放入离心机,室温低速(900-1500g)离心1h,再放入CO2培养箱继续感染;
5.可以进行重复感染,即第一次感染24-48h后再重新进行病毒感染,这样可以增加病毒感染细胞的机率;
6.延长表达检测时间,感染悬浮细胞,荧光观察时间会延长到72h或96h,并且荧光比较弱,需要耐心仔细观察。

«  2023-08-15
回复了主题  › 摇菌

如果加的量过多,甘油作为杂质可能会影响菌的生长,加的量少,可能菌数量太少难以摇浑;建议先在固体培养基划线或者涂布活化之后,挑单克隆,小量扩摇再大量扩摇。

«  2023-08-15
回复了主题  › 基因截断和定点突变

无缝克隆试剂盒设计引物进行150bp碱基的缺失的话,比如把这个目的基因分为A-B-C 3段(B是这150bp),目的基因头部引物For-A和尾部引物Rev-C仍正常设计(引物含与载体同源的序列15-20bp和目的基因序列);基因中要缺失B的这块的引物就跨越这150bp,合成用于扩增片段A的下游引物Rev-A和用于扩增片段C的上游引物For-C,Rev-A和For-C就在A的尾部和C的头部设计同源序列引物+一定长度的各自的片段序列。

然后For-A+Rev-A扩增片段A,For-C+Rev-C扩增片段C,与线性化的载体片段一起进行无缝克隆即可。

引物设计如下图解。或

«  2023-08-07
回复了主题  › 293T17可以用来包慢病毒吗?

293T/17是293T衍生出来的一个17号克隆,是293T细胞中共转染pBND和pZAP(wild-type moloney virus,小鼠白血病病毒M-MuLV改造而来)质粒而来,由于逆转录病毒片段的插入,可以用于包装产生高滴度逆转录病毒;

该细胞本身也仍保持293T细胞特性,具有高转染效率,可以用于慢病毒包装的。不过目前慢病毒包装使用最广泛的还是293T。

«  2023-08-07
«  2023-05-17
创建了主题  › 我想做circRNA的干扰慢病毒(lentivirus,LV)稳转株,怎么设计干扰靶点序列呀?

我想做circRNA的干扰慢病毒(lentivirus,

«  2023-05-17
«  2023-05-17
回复了主题  › 什么时候动物实验 选择使用腺病毒而不是腺相关病毒

1.需较短时间开始表达: AAV 感染后建议至少 2 周后做切片观察,一般是在感
染 3-4 周左右切片观察。如果需要时间更短的话会选择用腺病毒来做,一般3-5天到表达高峰,能维持2周左右的时间
2.载体容量较小:腺相关病毒载体的容量一般在3kb左右,插入的片段超过3kb则很难保证病毒滴度, 腺病毒能插入7kb左右的片段,如果要表达的基因过长只能考虑用腺病毒来做。

«  2023-05-10
回复了主题  › 加入腺病毒后,目的细胞死亡很厉害,为什么?

(1)观察未感染病毒时细胞的状态,细胞状态差或者细胞老化会影响后期感染病毒之后的细胞状态;
(2)病毒可能对目的细胞有一定的毒性,需要降低感染时的病毒 MOI,并且在不同时间后对细胞进行换液,用新鲜的完全培养液继续培养观察。

«  2023-05-10
回复了主题  › Polybrene 是什么?在慢病毒颗粒感染中, ,Polybrene 添加越多越好吗?

Polybrene(聚凝胺)名为溴化己二甲铵(hexadimethrine bromide),是一种阳离子聚合物。带正电的小分子,与细胞表面的阴离子结合。通常的使用浓度为 4-10 μg/mL,Polybrene能显著提高慢病毒的感染效率,通常能提高感染效率 2-10 倍,对部分细胞甚至可提高感染效率 10-20 倍。当目的细胞 MOI 高于 20 时,建议在培养基中加入 Ploybrene (约 4-10μg/mL) 适当提高感染效率。

«  2023-05-10
回复了主题  › 敲入和敲除有什么不同

做内源点突变需要 Cas9 和 donor:如果是直接合成的 donor 序列的话,同源臂的序列一般为 100bp,如果是用质粒或病毒的方式的话需要更长的同源臂,一般会合成突变位点上下1000bp 的基因,共 2000bp。
Knock in 实验的成功,除了 donor 的选择,实验之前保证 sgRNA 的特异性,验证 sgRNA的切割活性对于 Knockin 实验的成功也非常重要。

«  2023-05-10
«  2023-04-04
创建了主题  › 使用腺病毒(adenovirus,Ad)感染细胞多久后基因表达到达峰值啊?

使用腺病毒(adenovirus,Ad

«  2023-04-04
创建了主题  › 细胞感染腺病毒(adenovirus,Ad),细胞接种量我要怎么确定?

细胞感染腺病毒(adenovirus,Ad

«  2023-04-04