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橘子

用户名:橘子

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最后活动于15 天前
回复了主题  › 我有一个验证过的有编辑效率的gRNA,之前一直在细胞上做实验的,效果很好,现在想把这个gRNA包成AAV,注射Cas9基因小鼠可以吗?

Cas9有很多种类型,每种Cas9识别的PAM基序不同,gRNA的序列设计也有所不同,gRNA需要与相应的Cas9配合才能发挥最大作用,例如针对SpCas9设计的gRNA与SaCas9一起使用可能没有编辑效率。所以如果您实验的靶细胞和小鼠的Cas9是同一种Cas9,那么可以将该gRNA包装成AAV,注射Cas9基因小鼠;如果不是同一种Cas9,建议重新设计gRNA进行动物实验。

«  15 天前
回复了主题  › 我想过表达SELENOP这个基因,但是为什么从NCBI下载的CDS序列中间有很多终止密码子,这还能正常表达这个蛋白吗?

这是一种硒蛋白,硒半胱氨酸(Sec,U)由UGA密码子编码,一般情况下这个UGA表示翻译终止,但是硒蛋白mRNA的3' UTR包含一个保守的茎环结构,称为Sec插入序列(SECIS)元件,可以将UGA识别为Sec密码子而不是翻译终止信号,所以在过表达硒蛋白时需要将基因的CDS和3' UTR一起构建到载体上,这样就可以正常表达了。

«  15 天前
回复了主题  › 我转染了带荧光标记的siRNA,为什么对照组和实验组的siRNA在荧光显微镜下都看不到光?

我觉得可以考虑以下原因:
1.荧光易淬灭,注意避光。转染时室内和超净台内不开日光灯(FAM对避光要求更严格);

2.转染操作要快,操作时间要短,操作完毕后,尽快将培养板放到培养箱。
3.sirna本身有荧光标记,可以在换液前后观察确定是荧光淬灭还是转染效率不够导致的。

«  15 天前
回复了主题  › 我想通过荧光共振能量转移技术(FRET)验证两个蛋白的互作关系,这两种荧光该怎么选择?

FRET的荧光选择有几个基本原则:1.能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠;2.能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列;3.供体与受体的激发光谱要足够分离。可以选择已知的荧光团对进行FRET实验,例如CFP/YFP、CFP-dsRED、YFP-dsRED、BFP/GFP、GFP-dsRED、FITC-Rhodamine、FITC/Cy3、Alexa488-Alexa555等。

«  15 天前
创建了主题  › 有人知道pcdna3.1+/-质粒(plasmid)中的+、-是什么意思啊,有什么区别?

有人知道pcdna3.1+/-质粒(plasmid)中的+、-是什么意思啊,有什么区别?

«  2024-04-16
创建了主题  › 最近在做慢病毒(lentivirus,LV)转染,那转染后的细胞需要与其它普通细胞分开培养箱放吗?操作台需要分开吗?

最近在做慢病毒(lentivirus,LV)转染,那转染后的细胞需要与其它普通细胞分开培养箱放吗?操作台需要分开吗?

«  2024-04-16
创建了主题  › 我做的基因过表达质粒(plasmid)转染,但是质粒不带荧光,我可以做免疫荧光看转染效率吗?

我做的基因过表达质粒(plasmid)转染,但是质粒不带荧光,我可以做免疫荧光看转染效率吗?

«  2024-04-16
创建了主题  › 我的腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的病毒液从-80℃冰箱拿出来管子上有挂壁,我可以离下心吗?

我的腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的病毒液从-80℃冰箱拿出来管子上有挂壁,我可以离下心吗?

«  2024-04-16
回复了主题  › 为什么做质粒转染的时候建议用无血清、无双抗的培养基?

因为血清中含有大量的蛋白质,在转染过程中,带负电的蛋白质可能会干扰阳离子脂质体或阳离子聚合物与表面带负电荷的细胞膜的吸附作用从而影响转染效率;双抗一般对真核细胞无毒,但转染是阳离子脂质体实际增加了细胞的通透性,使双抗可以进入细胞,可能会降低细胞的活性,从而导致转染效率低、细胞状态差。所以转染过程一般建议使用无血清、无双抗的基础培养基,转染4-6小时后可换液为完全培养基。

«  2024-04-01
回复了主题  › 我想在你们这做一个基因敲除单克隆株,但是敲除之后细胞会不会不生长啊?

可以先查阅文献,有没有报道过敲除致死或者成功构建敲除株的案例,如果没有相关报道,建议先进行预实验,在cell pool阶段检测敲除效果是否逐渐减弱,进一步筛选单克隆时,鉴定不到两个等位基因都发生移码的单克隆,说明目的基因可能存在敲除致死或影响细胞生长。

«  2024-04-01
回复了主题  › 我在构建质粒的时候看到有的同学把荧光和目的基因融合表达了,这么做有什么目的吗,我也需要这么构建吗?

融合表达多用于目的蛋白亚细胞定位、蛋白互作等研究,可将目的蛋白基因和荧光蛋白基因融合到同一质粒或病毒载体中,构建融合基因表达载体,并转染至细胞内,表达的融合蛋白能行使目的蛋白的生物学功能,又有荧光蛋白的发光特点。如果不需要进行蛋白定位等实验,荧光可以不与基因融合,此时荧光作为转染效率的指标之一。

«  2024-04-01
回复了主题  › 我想过表达一个基因,但是为什么NCBI上显示有好多isoform,还有很多transcript variant,这些是什么意思?我应该选哪个做实验呢?

isoform对应的是在蛋白水平上的同源异构体,transcript variant指的是RNA水平的转录本,有时不同的variant可能对应一个isoform。

一个基因的多个转录本的产生通常是以下一种原因或者几种原因共同发生导致:选择性剪接;可变启动子;选择性翻译起始;核糖体移位(一种翻译重编码机制,多出现在病毒中)。

选择转录本需要查阅文献,哪个转录本是符合自己研究目的的。实在不知道选择哪个转录本的时候,可以尝试这几种方式:结合uniprot查询经典转录本,选经典转录本进行实验;用不同转录本的NM号和关键词到NCBI上去查,哪个NM号文章多,就用哪个;或者选

«  2024-04-01
创建了主题  › 进行慢病毒(Lentivirus,Lv)感染,请问如何根据我目的细胞的MOI(Multiplicity of Infection,感染复数)来确定所需要的慢病毒病毒液体积呀?

进行慢病毒(Lentivirus,Lv)感染,请问如何根据我目的细胞的MOI(Multiplicity of Infection,感染复数)来确定所需要的慢病毒病毒液体积呀?


«  2024-03-05
«  2024-03-05
创建了主题  › 我用慢病毒(Lentivirus,Lv)感染细胞后,使用嘌呤霉素(puromycin)成功筛选好稳转株后,还需要继续加嘌呤霉素吗?

我用慢病毒(Lentivirus,Lv)感染细胞后,使用嘌呤霉素(puromycin)成功筛选好稳转株后,还需要继续加嘌呤霉素吗?


«  2024-03-05
回复了主题  › 悬浮细胞怎么提高病毒感染效率?

感染悬浮或半悬浮细胞,可以通过平角离心转染法,即将适量的病毒液加入细胞培养皿后, 封好口,放入平角离心机后,低速(1200g)离心1 h,然后放入培养箱中正常培养即可。若由

«  2024-01-23
回复了主题  › Co-IP之后的Wb结果中,50kDa和25kDa那里总是有杂带怎么办?

50kDa和25kDa是抗体的轻重链,如果目的蛋白大小不在50kDa或25kDa附近,可以不用在乎这两杂带,如果目的蛋白大小靠近50kDa或25kDa,可以选择不同种属来源的一抗分别进行免疫沉淀和WB,然后再选择无种属交叉反应的二抗进行WB实验,或者选择特殊的二抗,比如只识别轻链或重链的二抗进行WB实验。

«  2024-01-23
回复了主题  › 为什么制SDS-PAGE胶的时候总是漏胶?

可以检查看看是否有以下5个问题:

1.玻璃板与桌面的接触面不平整;2.胶条没干燥,也容易导致漏胶,应晾干胶条后再使用;3.胶条已经老化,如果胶条有裂纹可以用保鲜膜垫在上面或者翻过来使用;4.如果玻璃板边缘(即与胶条接触处)发生破损,要更换新的玻璃板;5.玻璃板和胶条之间没有贴紧,可以在胶条下端垫纸或者使用封口膜使它与玻璃板贴得更紧。

«  2024-01-23
回复了主题  › 为什么在RNA的提取时。RNA总量会很低?

以下几个可能是潜在的原因,可以结合实验分析看看:1.在RNA提取中细胞是否裂解充分;2.要确保有足够的细胞量;3.在提取RNA时加入的试剂,例如Trizol、氯仿和异丙醇的比例是否正确;4.异丙醇加入后会出现分层,需要轻摇混匀,RNA溶液中异丙醇的浓度上不去是不会出现RNA沉淀的;5.最后加DEPC水溶解RNA沉淀时,先加10uL,溶解后检测一下浓度再稀释。

«  2024-01-23
创建了主题  › 腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的包装容量有多大?

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的包装容量有多大?

«  2024-01-02
创建了主题  › 有没有什么办法可以提高腺病毒(adenovirus,Ad)对细胞的感染效率?

有没有什么办法可以提高腺病毒(adenovirus,Ad)对细胞的感染效率?

«  2024-01-02
创建了主题  › 我的过表达序列有几个氨基酸位点的同义突变,影响qpcr检测过表达效果么?

我的过表达序列有几个氨基酸位点的同义突变,影响qpcr检测过表达效果

«  2024-01-02
创建了主题  › circRNA过表达慢病毒这个需要加flag蛋白标签吗?

circRNA过表达慢病毒这个需要加flag蛋白标签吗?


«  2024-01-02
回复了主题  › 转染siRNA之后没有干扰效率是怎么回事?

1.实验操作是否正确:通过荧光标签检测转染效率或者通过对照检查转染和检测程序的正确性。
2.检测时间是否合适:一般在转染siRNA 24-48h后通过qPCR检测干扰效率。
3.细胞状态是否良好:建议选择代数低、密度合适的细胞进行转染,对于不好转染的细胞比如悬浮细胞或干细胞,可以采用电转或者病毒感染的方式。
4.干扰序列是否有效:检查干扰序列设计程序,尝试使用多条siRNA序列。并且siRNA序列容易降解,导致效率下降,siRNA溶解后要分装保存于-20℃。

«  2023-12-20
回复了主题  › IP后的WB结果中背景很高,有办法让图好看一点吗?

图好看主要可以通过以下几种方式让背景更干净:1.制备样品中可能有不完全溶解的大的蛋白复合体,可以在制备样品后进行短暂的超声处理,然后离心纯化,取上清进行实验;2.也可能是洗涤不彻底,多次洗涤并逐渐增加洗涤缓冲液中的NaCl和去垢剂浓度;3.或者是非特异性蛋白吸附在了磁珠上,需要进行预处理防止非特异性吸附;4.使用了过多的细胞或者组织进行裂解,减少细胞或组织用量,调整裂解物浓度到1ug/ml。

«  2023-12-20
回复了主题  › 我想干扰敲低一个miRNA,有什么方法吗?

干扰miRNA主要是通过封闭其功能来实现,miRNA的数量是不变的。常用的方法有:Inhibitor,是化学修饰的成熟miRNA反向互补链,比较适合细胞实验;Antagomir,是特殊化学修饰的成熟miRNA反向互补链,相对Inhibitor而言更稳定,主要用于动物实验;Sponge,是多条miRNA反向互补链连接在一起,可以构建到病毒载体中,互补链之间用linker连接,可以用于细胞实验、动物实验。

«  2023-12-20
回复了主题  › 我把siRNA的浓度加大了为什么敲低效率反而降低了?

siRNA浓度不是越高敲低效率越高,高浓度的siRNA可能会增加非特异性作用的可能性,产生脱靶效应并对细胞产生毒性,转染试剂的浓度与siRNA的浓度也不是严格的线性相关,要在说明书的指导下操作。

«  2023-12-20
创建了主题  › 我做敲低,mRNA有降低,为何蛋白的抑制没有mRNA那么明显呢?甚至有时候遇到mrna降低很明显,蛋白却没有降低。

我做敲低,mRNA有降低,为何蛋白的抑制没有mRNA那么明显呢?甚至有时候遇到mrna降低很明显,蛋白却没有降低。

«  2023-12-04
创建了主题  › 我做敲低,siRNA下调效果很好,但是包装成shRNA病毒后,下调效果变差了,这是为什么呢?

我做敲低,siRNA下调效果很好,但是包装成shRNA病毒后,下调效果变差了,这是为什么呢?

«  2023-12-04