我用PURO抗性的慢病毒感染细胞表达后，用嘌呤霉素筛选了感染阳性的细胞，那后续培养还需要加嘌呤霉素吗？
我常用的有两种方法：一种是通过真核细胞抗性药物筛选，例如puro；一种是让细胞带上荧光信号，利用流式细胞仪分选得到荧光信号阳性的细胞。
建议选择生物发光Luc，GFP和RFP等背景太高，灵敏度低，因此不是很推荐。
(1)病毒包装不成功。
(2)滴度不够。
(3)被感染的细胞不同，其MOI值不同，要根据细胞类型适当调整加入的病毒量。
(4)荧光只是观察病毒感染效果的一个辅助方式，荧光强弱不代表目的基因的表达量高低，基因表达水平需要通过基因表达水平需要通过qPCR或者WB来鉴定。
抗支原体：抑制按照1：1000的比例加到培养基中，预防按1：2000比例加；黑胶虫：按照1：500比例加到培养基中；两个可以同时加。
如果我用T2A或IRES连接2个基因进行过表达，比如 基因A—T2A/IRES—基因B，那么我前面的 基因A 需要加终止密码子吗？
我用慢病毒感染我的目的细胞进行基因过表达，qpcr检测目的组相对于对照组上调上万倍，这正常吗？
lncRNA是长链非编码RNA，转录出来的RNA并不会翻译成蛋白质。2A肽是在蛋白水平实现基因的分隔表达，所以不能用于此种载体设计。IRES可在RNA水平实现基因分隔表达，但是转录出来的RNA是荧光蛋白序列、IRES和lncRNA序列的融合，荧光蛋白和IRES序列可能会严重影响lncRNA功能，所以也不建议使用。一般都会选择双启动子载体，分别启动荧光及lncRNA。
感染全脑我觉得可以考虑用跨血脑屏障血清型BBB的腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）进行尾静脉注射；如果要感染全脑小胶质细胞我觉得可以考虑用跨血脑屏障血清型BBB并结合小胶质细胞特异性
CCRF-CEM是悬浮细胞，悬浮细胞比较难感染，可以进行以下尝试：
1.添加适量的助转剂；
2.按照说明书进行小体积感染法；
3.延长感染时间，每隔一段时间晃动培养板混匀一次；
4.转染后放入离心机，室温低速（900-1500g）离心1h，再放入CO2培养箱继续感染；
5.可以进行重复感染，即第一次感染24-48h后再重新进行病毒感染，这样可以增加病毒感染细胞的机率；
6.延长表达检测时间，感染悬浮细胞，荧光观察时间会延长到72h或96h，并且荧光比较弱，需要耐心仔细观察。
如果加的量过多，甘油作为杂质可能会影响菌的生长，加的量少，可能菌数量太少难以摇浑；建议先在固体培养基划线或者涂布活化之后，挑单克隆，小量扩摇再大量扩摇。
无缝克隆试剂盒设计引物进行150bp碱基的缺失的话，比如把这个目的基因分为A-B-C 3段（B是这150bp），目的基因头部引物For-A和尾部引物Rev-C仍正常设计（引物含与载体同源的序列15-20bp和目的基因序列）；基因中要缺失B的这块的引物就跨越这150bp，合成用于扩增片段A的下游引物Rev-A和用于扩增片段C的上游引物For-C，Rev-A和For-C就在A的尾部和C的头部设计同源序列引物+一定长度的各自的片段序列。
然后For-A+Rev-A扩增片段A，For-C+Rev-C扩增片段C，与线性化的载体片段一起进行无缝克隆即可。
引物设计如下图解。或
293T/17是293T衍生出来的一个17号克隆，是293T细胞中共转染pBND和pZAP（wild-type moloney virus，小鼠白血病病毒M-MuLV改造而来）质粒而来，由于逆转录病毒片段的插入，可以用于包装产生高滴度逆转录病毒；
该细胞本身也仍保持293T细胞特性，具有高转染效率，可以用于慢病毒包装的。不过目前慢病毒包装使用最广泛的还是293T。
我用慢病毒（lenti
我要做慢病毒（lentivirus，LV
我想做circRNA的干扰慢病毒（lentivirus，
3FLGA 有多大啊
1.需较短时间开始表达： AAV 感染后建议至少 2 周后做切片观察，一般是在感
染 3-4 周左右切片观察。如果需要时间更短的话会选择用腺病毒来做，一般3-5天到表达高峰，能维持2周左右的时间
2.载体容量较小：腺相关病毒载体的容量一般在3kb左右，插入的片段超过3kb则很难保证病毒滴度， 腺病毒能插入7kb左右的片段，如果要表达的基因过长只能考虑用腺病毒来做。
（1）观察未感染病毒时细胞的状态，细胞状态差或者细胞老化会影响后期感染病毒之后的细胞状态；
（2）病毒可能对目的细胞有一定的毒性，需要降低感染时的病毒 MOI，并且在不同时间后对细胞进行换液，用新鲜的完全培养液继续培养观察。
Polybrene（聚凝胺）名为溴化己二甲铵（hexadimethrine bromide），是一种阳离子聚合物。带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合。通常的使用浓度为 4-10 μg/mL，Polybrene能显著提高慢病毒的感染效率，通常能提高感染效率 2-10 倍，对部分细胞甚至可提高感染效率 10-20 倍。当目的细胞 MOI 高于 20 时，建议在培养基中加入 Ploybrene (约 4-10μg/mL) 适当提高感染效率。
做内源点突变需要 Cas9 和 donor：如果是直接合成的 donor 序列的话，同源臂的序列一般为 100bp，如果是用质粒或病毒的方式的话需要更长的同源臂，一般会合成突变位点上下1000bp 的基因，共 2000bp。
Knock in 实验的成功，除了 donor 的选择，实验之前保证 sgRNA 的特异性，验证 sgRNA的切割活性对于 Knockin 实验的成功也非常重要。
为什么我做的慢病毒（lentivirus，LV
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Puro抗性和氨苄抗性是一回事吗？