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橘子

用户名:橘子

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最后活动于2024-01-23
回复了主题  › 悬浮细胞怎么提高病毒感染效率?

感染悬浮或半悬浮细胞,可以通过平角离心转染法,即将适量的病毒液加入细胞培养皿后, 封好口,放入平角离心机后,低速(1200g)离心1 h,然后放入培养箱中正常培养即可。若由

«  2024-01-23
回复了主题  › Co-IP之后的Wb结果中,50kDa和25kDa那里总是有杂带怎么办?

50kDa和25kDa是抗体的轻重链,如果目的蛋白大小不在50kDa或25kDa附近,可以不用在乎这两杂带,如果目的蛋白大小靠近50kDa或25kDa,可以选择不同种属来源的一抗分别进行免疫沉淀和WB,然后再选择无种属交叉反应的二抗进行WB实验,或者选择特殊的二抗,比如只识别轻链或重链的二抗进行WB实验。

«  2024-01-23
回复了主题  › 为什么制SDS-PAGE胶的时候总是漏胶?

可以检查看看是否有以下5个问题:

1.玻璃板与桌面的接触面不平整;2.胶条没干燥,也容易导致漏胶,应晾干胶条后再使用;3.胶条已经老化,如果胶条有裂纹可以用保鲜膜垫在上面或者翻过来使用;4.如果玻璃板边缘(即与胶条接触处)发生破损,要更换新的玻璃板;5.玻璃板和胶条之间没有贴紧,可以在胶条下端垫纸或者使用封口膜使它与玻璃板贴得更紧。

«  2024-01-23
回复了主题  › 为什么在RNA的提取时。RNA总量会很低?

以下几个可能是潜在的原因,可以结合实验分析看看:1.在RNA提取中细胞是否裂解充分;2.要确保有足够的细胞量;3.在提取RNA时加入的试剂,例如Trizol、氯仿和异丙醇的比例是否正确;4.异丙醇加入后会出现分层,需要轻摇混匀,RNA溶液中异丙醇的浓度上不去是不会出现RNA沉淀的;5.最后加DEPC水溶解RNA沉淀时,先加10uL,溶解后检测一下浓度再稀释。

«  2024-01-23
创建了主题  › 腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的包装容量有多大?

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的包装容量有多大?

«  2024-01-02
创建了主题  › 有没有什么办法可以提高腺病毒(adenovirus,Ad)对细胞的感染效率?

有没有什么办法可以提高腺病毒(adenovirus,Ad)对细胞的感染效率?

«  2024-01-02
创建了主题  › 我的过表达序列有几个氨基酸位点的同义突变,影响qpcr检测过表达效果么?

我的过表达序列有几个氨基酸位点的同义突变,影响qpcr检测过表达效果

«  2024-01-02
创建了主题  › circRNA过表达慢病毒这个需要加flag蛋白标签吗?

circRNA过表达慢病毒这个需要加flag蛋白标签吗?


«  2024-01-02
回复了主题  › 转染siRNA之后没有干扰效率是怎么回事?

1.实验操作是否正确:通过荧光标签检测转染效率或者通过对照检查转染和检测程序的正确性。
2.检测时间是否合适:一般在转染siRNA 24-48h后通过qPCR检测干扰效率。
3.细胞状态是否良好:建议选择代数低、密度合适的细胞进行转染,对于不好转染的细胞比如悬浮细胞或干细胞,可以采用电转或者病毒感染的方式。
4.干扰序列是否有效:检查干扰序列设计程序,尝试使用多条siRNA序列。并且siRNA序列容易降解,导致效率下降,siRNA溶解后要分装保存于-20℃。

«  2023-12-20
回复了主题  › IP后的WB结果中背景很高,有办法让图好看一点吗?

图好看主要可以通过以下几种方式让背景更干净:1.制备样品中可能有不完全溶解的大的蛋白复合体,可以在制备样品后进行短暂的超声处理,然后离心纯化,取上清进行实验;2.也可能是洗涤不彻底,多次洗涤并逐渐增加洗涤缓冲液中的NaCl和去垢剂浓度;3.或者是非特异性蛋白吸附在了磁珠上,需要进行预处理防止非特异性吸附;4.使用了过多的细胞或者组织进行裂解,减少细胞或组织用量,调整裂解物浓度到1ug/ml。

«  2023-12-20
回复了主题  › 我想干扰敲低一个miRNA,有什么方法吗?

干扰miRNA主要是通过封闭其功能来实现,miRNA的数量是不变的。常用的方法有:Inhibitor,是化学修饰的成熟miRNA反向互补链,比较适合细胞实验;Antagomir,是特殊化学修饰的成熟miRNA反向互补链,相对Inhibitor而言更稳定,主要用于动物实验;Sponge,是多条miRNA反向互补链连接在一起,可以构建到病毒载体中,互补链之间用linker连接,可以用于细胞实验、动物实验。

«  2023-12-20
回复了主题  › 我把siRNA的浓度加大了为什么敲低效率反而降低了?

siRNA浓度不是越高敲低效率越高,高浓度的siRNA可能会增加非特异性作用的可能性,产生脱靶效应并对细胞产生毒性,转染试剂的浓度与siRNA的浓度也不是严格的线性相关,要在说明书的指导下操作。

«  2023-12-20
创建了主题  › 我做敲低,mRNA有降低,为何蛋白的抑制没有mRNA那么明显呢?甚至有时候遇到mrna降低很明显,蛋白却没有降低。

我做敲低,mRNA有降低,为何蛋白的抑制没有mRNA那么明显呢?甚至有时候遇到mrna降低很明显,蛋白却没有降低。

«  2023-12-04
创建了主题  › 我做敲低,siRNA下调效果很好,但是包装成shRNA病毒后,下调效果变差了,这是为什么呢?

我做敲低,siRNA下调效果很好,但是包装成shRNA病毒后,下调效果变差了,这是为什么呢?

«  2023-12-04
创建了主题  › 目的基因融合荧光,会因为担心融合荧光影响目的蛋白功能在目的基因和荧光中间加一个linker吗?

目的基因融合荧光,会因为担心融合荧光影响目的蛋白功能在目的基因和荧光中间加一个linker吗?

«  2023-12-04
创建了主题  › 慢病毒做的敲低稳转细胞株的复苏传代操作和正常细胞有什么区别吗?

慢病毒做的敲低稳转细胞株的复苏传代操作和正常细胞有什么区别吗?

«  2023-12-04
回复了主题  › 双荧光素酶实验中报告基因和内参基因质粒共转染的比例是怎样的?

基本原则是内参基因被准确检测,同时不干扰报告基因的表达,可以选择活性较低的TK启动子驱动的内参基因载体,报告基因质粒和内参基因质粒比例在10:1到100:1之间比较常见,但也可能会超出这个比例,建议进行预实验摸索一下最适比例。

«  2023-11-21
回复了主题  › 带荧光标记的病毒做石蜡切片会显色吗?

石蜡切片需要做免疫荧光,荧光二抗尽可能避开病毒带的荧光颜色,做冰冻切片可以直接观察荧光。

«  2023-11-21
回复了主题  › 冰冻切片发现背景很高,出现许多异常明亮的亮点是怎么回事?

背景很高的原因主要是组织太干,一方面可能是由于在多聚甲醛中浸泡的时间太久,另一方面可能是由于切片后组织晾的太干燥。明亮的亮点可能是PBS没有过滤就用来洗片子,里面有杂质,或者是镜头上面的杂质,有些亮点可能也与组织本身的结构有关。

«  2023-11-21
回复了主题  › AAV可以感染细胞吗?

可以,但不建议,因为AAV体外实验表达水平较低,一方面是由于rAAV病毒的基因组是单链DNA,在体外环境形成双链并转录翻译外源基因的效率非常低。另一方面,AAV对细胞毒性低,体外的细胞加入AAV病毒后,对细胞的分裂生长能力影响不大,因而随着细胞的分裂,对于AAV载体是一种稀释作用,这也导致其在细胞实验中的表达效率不高。并且AAV感染细胞时需要很高的moi,通常moi需要大于10^4才能检测到外源基因的表达,达到10^5~10^6才能获得理想的表达效果。

«  2023-11-21
创建了主题  › 我用嘌呤霉素(puromycin)摸索细胞适合的浓度,但是用到10ug/ml的浓度48小时仍杀不死空白细胞是什么原因呢?

我用嘌呤霉素(puromycin)摸索细胞适合的浓度,但是用到10ug/ml的浓度48小时仍杀不死空白细胞是什么原因呢?

«  2023-11-01
创建了主题  › 一个启动子启动两个基因表达时,T2A连接和IRES连接有什么区别?

一个启动子启动两个基因表达时,T2A连接和IRES连接有什么区别?

«  2023-11-01
创建了主题  › 我有2个目的片段要连到载体上,可以直接用无缝克隆试剂盒来做吗?

我有2个目的片段要连到载体上,可以直接用无缝克隆试剂盒来做吗?

«  2023-11-01
创建了主题  › 慢病毒使用完就需要放-80℃吗?

慢病毒(lentivirus, LV)使用完就需要放-80℃吗?

«  2023-11-01
回复了主题  › 为什么同一个siRNA在一种细胞中敲低效率很明显,换成另一种细胞就没有敲低了呢?

同一个基因在不同细胞中的信号通路传导、基因表达水平、生理特性上存在差别,导致siRNA的转染效率、对靶基因的降解能力、降解后细胞功能和状态存在差异,在实验结果上就表现出siRNA的敲低水平不同。

«  2023-10-23
回复了主题  › 细胞污染了怎么处理?

一般情况下,被污染的细胞应立即丢弃,并对细胞间的器材试剂等进行杀菌消毒处理,但若是珍贵细胞,不舍得丢掉,首先要辨别污染类型,再采取相应的措施:
细菌污染比较容易发现和辨别,细胞培养基在6-8h后呈现混浊,有时稍加震荡,便会有很多混浊物漂起,显微镜下观察呈黑色细沙状,或背景有大量黑点,对于细菌污染,联合使用青霉素、链霉素等抗生素能有效防治。
真菌污染最短3天才能长出椭圆形的霉斑,霉斑往往会漂浮在培养液表面,随着时间逐步扩大,有些真菌呈类似棉花絮状的漂浮物,若是念珠菌会呈卵圆状,在细胞周边生长。真菌污染时细胞培养液一般不会变浑浊,但在显微镜下可观察到菌丝体。真菌污染可以使用抗

«  2023-10-23
回复了主题  › 我想构建一个稳转株,这对细胞类型有要求吗?

首先需要是能稳定传代的细胞系,原代细胞传代次数有限,一般不用来构建稳转株;其次要考虑细胞和插入片段的兼容性,部分稳转株筛选后会出现插入片段丢失的现象,建议在进行正式筛选前进行预实验或挑选单克隆细胞株避免类似的问题发生。

«  2023-10-23
回复了主题  › 为什么我的细胞感染慢病毒之后状态变差了

如果是自己包装的慢病毒,可能是病毒纯度不够或者有支原体污染等,但是公司包装的慢病毒有成熟的纯化工艺,一般不会出现这种情况;如果是敏感细胞,MOI过高也会出现状态变差的现象,需要在正式实验前摸索最适MOI,并且及时换液;最后也可能和目的基因有关,研究的基因与生命周期活动有关,对这个基因过表达或者干扰之后影响了细胞状态。

«  2023-10-23
创建了主题  › Puro抗性和氨苄抗性是一回事吗?

Puro抗性和氨苄抗性是一回事吗?


«  2023-09-27
创建了主题  › 纯化腺病毒注射动物后多久表达呀?如果我的实验周期1个月,注射1次可以吗?

纯化腺病毒注射动物后多久表达呀?如果我的实验周期1个月,注射1次可以吗?


«  2023-09-27