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橘子

用户名:橘子

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最后活动于8 天前
回复了主题  › 慢病毒(lentivirus)基因组是如何整合到基因组的?是那个范围的序列

慢病毒通过自身的 3’和 5’LTR 整合入基因组,整合方式为非定向随机整合。

«  8 天前
回复了主题  › 腺相关病毒(AAV) 注射一次在多长时间内都有敲低/过表达的效果?

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)一般是可以维持 3 个月到半年,在这个时间内理论上都有干扰/ 过表达效果,但是不排除特殊情况下部分 AAV 一个月后可能就检测不到了,或者是到 3 个月的时候效果有下降。如果实验周期较长,可以复注射感染。

«  8 天前
回复了主题  › 双荧光素酶实验启动子活性验证,必须要过表达一个转录因子么?

不是必须的,启动子活性验证可以单独验证启动子是否有活性,直接构建 Pgl3-Basic 载体转染检测就好, 也可以验证启动子和转录因子相互作用,也就是研究转录因子对启动子活性是否有影响,需要转录因子质粒和启动子活性质粒共同转染细胞。


«  8 天前
回复了主题  › 做细胞永生化推荐什么病毒?

细胞永生化一般推荐 sv40t 和 tert 过表达慢病毒(lentivrus, LV),SV40T 长度 2k以内,tert 比较大 ,3.3k ,一般建议两个病毒一起用,如果只想用一个 ,推荐 sv40t ,单独用这个较为常见,但现有的细胞系也有用Tert构建的。

«  8 天前
创建了主题  › 腺相关病毒(adeno-associate virus,AAV)体内注射方法有什么呀,我想感染小鼠海马怎么选择注射方法?

腺相关病毒(adeno-associate virus,AAV)体内注射方法有什么呀,我想感染小鼠海马怎么选择注射方法?

«  17 天前
创建了主题  › 慢病毒(lentivirus,LV)、腺病毒(adenovirus,AD)、腺相关病毒(adeno-associate virus,AAV)使用时有什么相关注意事项吗?

慢病毒(lentivirus,LV)、腺病毒(adenovirus,AD)、腺相关病毒(adeno-associate virus,AAV)使用时有什么相关注意事项吗?

«  17 天前
创建了主题  › 为什么我用慢病毒(lentivirus,LV)筛选好稳定株后,继续培养出现了基因过表达或者干扰效果的丢失? 为什么我用慢病毒(lentivirus,LV)筛选好稳定株后,继续培养出现了基因过表达或者干扰效果的丢失?
«  17 天前
创建了主题  › 用慢病毒(lentivirus,LV)构建稳定细胞株药物筛选时,为什么细胞荧光正常,药物筛选后大量荧光阳性细胞死亡?

用慢病毒(lentivirus,LV)构建稳定细胞株药物筛选时,为什么细胞荧光正常,药物筛选后大量荧光阳性细胞死亡?

«  17 天前
«  22 天前
«  22 天前
回复了主题  › 谁能告诉我什么是DIO系统,是怎么运作的,原理是什么

通过引入两对不相容的反向 Lox 位点 LoxP 和 Lox2272,经过两组 Lox 位点的两轮重组可达到一种稳定状态。也就是可以通过 Cre 重组酶的存在与否来控制基因的表达。这种策略被称为 DIO(Cre-on)或 DO(Cre-off)。在这种策略下,任一对 Lox 位点间的序列会在 Cre 的作用下发生可逆的快速翻转,之后 Cre 重组酶马上不可逆地切割翻转后的同向 Lox 位点,只留下翻转

«  22 天前
回复了主题  › 荧光素酶和荧光蛋白的检测仪器相同吗?是一种东西吗?fluc是哪一种?

不相同,两者的发光原理不一样。fluc是萤火虫荧光素酶。
①荧光素酶本身不发光,它能催化底物发生反应,同时发出荧光,检测时需要加入底物,
检测仪器是发光检测仪或多功能酶标仪;
②荧光蛋白是生色基团在较高能量的光子照射下发生构象的改变,从而导致分子能级变
化,从高能级的构象跃迁向低能级时发出荧光,所以荧光蛋白的检测需要激发光的激发,检
测仪器为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

«  22 天前
回复了主题  › WB 、western blot蛋白条带大小与理论值不符,可能是什么原因?

①首先要确定您样品是内源性蛋白还是重组蛋白,如果是重组蛋白,表达的是否是全长
序列,如果不是,条带大小是会有差异的哦;
②如果确定上一条没有问题,那看看目标蛋白是不是有其他转录本,可参考NCBI相应基因信息;
③蛋白质本身有修饰如糖基化、磷酸化等均会增大蛋白分子量;
④蛋白发生了翻译后剪切,可查阅文献,确认蛋白是否存在多种剪切活性形式;
⑤所检测的抗原可能形成了二聚体或多聚体,可以延长煮沸时间,打开蛋白二聚体或
多聚体。

«  22 天前
回复了主题  › 活体成像推荐什么病毒,腺相关病毒(AAV)可以吗?有什么荧光蛋白能使用?我看有用荧光素酶(luc)和荧光蛋白的比如EGFP、zsGREEN

如果想先筛稳定株后注射入动物体内,用慢病毒LV(建议 luc+puro 双标,luc+gfp+puro 的luc 检测效果不太好);如果病毒直接注射推荐带luc 的高滴度腺病毒Ad或者腺相关病毒AAV,实验周期比较短(两周以内)同时要求快速检测,建议腺病毒,实验周期长建议AAV,动物实验优更建议 AAV,注意不同血清型选择。

«  29 天前
回复了主题  › 病毒一般是溶解在什么液体中的?

慢病毒 DMEM培养基
非纯化腺病毒 DMEM培养基
纯化腺病毒 纯化的透析液
AAV PBS

«  2023-02-22
回复了主题  › CAS9 慢病毒为什么做的滴度不高?

cas9 滴度不高主要原因是基因太大了(4400bp)。

«  2023-02-22
回复了主题  › 腺病毒感染离体细胞后多久到表达高峰?腺病毒用于动物在体实验可以维持多长时间?

离体细胞是指细胞系或原代培养的细胞。因为此类细胞要么增殖能力特别强,要
么不增殖,要么不能长时间培养,腺病毒感染离体细胞一般 36h 到表达高峰,可
以持续表达四五天,之后就表达慢慢减弱,直至在细胞内被完全降解。
体内实验中,因为组织细胞一般都是终末端分化的,而且体内细胞更新比较慢,
所以腺病毒在体内可以维持

«  2023-02-22
回复了主题  › 稳转株都是用什么病毒做的?一般稳定株怎么筛选?

慢病毒和逆转录病毒都可以做稳定细胞株,因为逆转录病毒应用较少,所以市面
上的技术服务公司都是用慢病毒来筛稳定株的。
稳定株筛选方法有两种:
其一是通过真核细胞抗性药物筛选,常见的如 puromycin、G418、BSD 等,杀死
阴性细胞,得到阳性细胞,我们就是用的这种方法;
其二是让细胞带上荧光信号,利用流式细胞仪分选得到荧光信号阳性的细胞,扩
大培养得到稳定细胞株。

«  2023-02-22
创建了主题  › dCas9区别于Cas9 的是什么?


dCas9区别于Cas9 的是什么?

«  2023-02-14
创建了主题  › 腺相关病毒AAV 辅助质粒的作用是什么?

腺相关病毒AAV 辅助质粒的作用是什么?

«  2023-02-14
创建了主题  › ​特异性的启动子和不同血清型的腺相关病毒AAV实现“特异”的基本原理

特异性的启动子和不同血清型的腺相关病毒AAV实现“特异”的基本原理

«  2023-02-14
创建了主题  › 细胞状态不好有哪些原因,如何判断是黑胶虫污染还是支原体?

细胞状态不好有哪些原因,如何判断是黑胶虫污染还是支原体?

«  2023-02-14
回复了主题  › Cas9敲除编码基因和非编码基因有什么区别?

编码基因依靠3联体密码子来编码蛋白,最终通过蛋白序列来发挥功能,在做敲除的时候,某一个点的改变就可以导致这个序列翻译出来的蛋白序列发生改变,即移码突变,这样的突变就可以导致蛋白功能的丧失。
非编码基因是以RNA的形式作用,某个位点发生改变后很难使其丧失功能,除非这个位点是该序列发生作用的唯一位点(这种情况概率极小,相当于是基因组的定点突变),所以非编码的敲除需要在两端各设计一条gRNA来进行片段敲除,但这两条gRNA需要都能有效且同时切割才能敲除成功,所以非编码基因的敲除比较难做。

«  2023-02-07
回复了主题  › RNAi干扰,mRNA变化明显但是wb没变化,什么原因?

答:蛋白本身可能受多因素调控,RNAi是针对转录水平的调控,到蛋白多一步翻译,某些情况下不能保证mRNA完全与蛋白水平一致。
(1)该蛋白的半衰期比较长,导致在检测时,之前表达的蛋白还未降解,确定半衰期需要用测定半衰期的方法检测,具体是用一些蛋白合成抑制剂处理后,隔一定时间检测该蛋白的水平;这种情况可以建议客户多隔一段时间再检测;
(2)该蛋白有多种转录本,可能有不同isoform的蛋白,要确定下是不是这条siRNA是针对所有的转录本;
(3)另外最后的可能就是该基因的翻译效率较高,较少mRNA仍能维持较高的蛋白水平。

«  2023-02-07
回复了主题  › 活体成像的底物选择及注射方式

1)有两种荧光素酶,包括海肾荧光素酶(Ranilla Luciferase,rluc)和萤火虫荧光素酶(Firefil Luciferase,fluc),荧光素酶的发光不需要激发光,但是需要底物荧光素,前者底物是肠腔素,后者底物是D-荧光素(D-Luciferin)。大部分的发表文章通常使用萤火虫荧光素酶(fluc)用作报告基因,当然也有用双标记的,我们常规的载体带luc标记的是fluc。
(2)D-荧光素(D-Luciferin),包括D-荧光素钾盐和钠盐,二者在使用效果上无区别,在物理特征上荧光素钠盐溶解度会高于钾盐。但是在体内实验研究中,有更多的研究者倾

«  2023-02-07
回复了主题  › 做活体成像推荐什么病毒

如果是先筛稳定株后注射入动物体内,用慢病毒,luc标记;如果病毒直接注射推荐带luc 的高滴度腺病毒或者 AAV;实验周期比较短(两周以内)同时要求快速检测,推荐腺病毒,实验周期长推荐 AAV,动物实验优推 AAV,注意不同血清型选择。

«  2023-02-07