腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）一般是可以维持 3 个月到半年，在这个时间内理论上都有干扰/ 过表达效果，但是不排除特殊情况下部分 AAV 一个月后可能就检测不到了，或者是到 3 个月的时候效果有下降。如果实验周期较长，可以复注射感染。
不是必须的，启动子活性验证可以单独验证启动子是否有活性，直接构建 Pgl3-Basic 载体转染检测就好， 也可以验证启动子和转录因子相互作用，也就是研究转录因子对启动子活性是否有影响，需要转录因子质粒和启动子活性质粒共同转染细胞。
细胞永生化一般推荐 sv40t 和 tert 过表达慢病毒（lentivrus, LV），SV40T 长度 2k以内，tert 比较大 ，3.3k ，一般建议两个病毒一起用，如果只想用一个 ，推荐 sv40t ，单独用这个较为常见，但现有的细胞系也有用Tert构建的。
腺相关病毒（adeno-associate virus，AAV）体内注射方法有什么呀，我想感染小鼠海马怎么选择注射方法？
慢病毒（lentivirus，LV）、腺病毒（adenovirus，AD）、腺相关病毒（adeno-associate virus，AAV）使用时有什么相关注意事项吗？
用慢病毒（lentivirus,LV）构建稳定细胞株药物筛选时，为什么细胞荧光正常，药物筛选后大量荧光阳性细胞死亡？
通过引入两对不相容的反向 Lox 位点 LoxP 和 Lox2272，经过两组 Lox 位点的两轮重组可达到一种稳定状态。也就是可以通过 Cre 重组酶的存在与否来控制基因的表达。这种策略被称为 DIO（Cre-on）或 DO（Cre-off）。在这种策略下，任一对 Lox 位点间的序列会在 Cre 的作用下发生可逆的快速翻转，之后 Cre 重组酶马上不可逆地切割翻转后的同向 Lox 位点，只留下翻转
不相同，两者的发光原理不一样。fluc是萤火虫荧光素酶。
①荧光素酶本身不发光，它能催化底物发生反应，同时发出荧光，检测时需要加入底物，
检测仪器是发光检测仪或多功能酶标仪；
②荧光蛋白是生色基团在较高能量的光子照射下发生构象的改变，从而导致分子能级变
化，从高能级的构象跃迁向低能级时发出荧光，所以荧光蛋白的检测需要激发光的激发，检
测仪器为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
①首先要确定您样品是内源性蛋白还是重组蛋白，如果是重组蛋白，表达的是否是全长
序列，如果不是，条带大小是会有差异的哦；
②如果确定上一条没有问题，那看看目标蛋白是不是有其他转录本，可参考NCBI相应基因信息；
③蛋白质本身有修饰如糖基化、磷酸化等均会增大蛋白分子量；
④蛋白发生了翻译后剪切，可查阅文献，确认蛋白是否存在多种剪切活性形式；
⑤所检测的抗原可能形成了二聚体或多聚体，可以延长煮沸时间，打开蛋白二聚体或
多聚体。
如果想先筛稳定株后注射入动物体内，用慢病毒LV（建议 luc+puro 双标，luc+gfp+puro 的luc 检测效果不太好）；如果病毒直接注射推荐带luc 的高滴度腺病毒Ad或者腺相关病毒AAV，实验周期比较短（两周以内）同时要求快速检测，建议腺病毒，实验周期长建议AAV，动物实验优更建议 AAV，注意不同血清型选择。
慢病毒 DMEM培养基
非纯化腺病毒 DMEM培养基
纯化腺病毒 纯化的透析液
AAV PBS
cas9 滴度不高主要原因是基因太大了（4400bp）。
离体细胞是指细胞系或原代培养的细胞。因为此类细胞要么增殖能力特别强，要
么不增殖，要么不能长时间培养，腺病毒感染离体细胞一般 36h 到表达高峰，可
以持续表达四五天，之后就表达慢慢减弱，直至在细胞内被完全降解。
体内实验中，因为组织细胞一般都是终末端分化的，而且体内细胞更新比较慢，
所以腺病毒在体内可以维持
慢病毒和逆转录病毒都可以做稳定细胞株，因为逆转录病毒应用较少，所以市面
上的技术服务公司都是用慢病毒来筛稳定株的。
稳定株筛选方法有两种：
其一是通过真核细胞抗性药物筛选，常见的如 puromycin、G418、BSD 等，杀死
阴性细胞，得到阳性细胞，我们就是用的这种方法；
其二是让细胞带上荧光信号，利用流式细胞仪分选得到荧光信号阳性的细胞，扩
大培养得到稳定细胞株。
dCas9区别于Cas9 的是什么？
腺相关病毒AAV 辅助质粒的作用是什么？
特异性的启动子和不同血清型的腺相关病毒AAV实现“特异”的基本原理
细胞状态不好有哪些原因，如何判断是黑胶虫污染还是支原体？
编码基因依靠3联体密码子来编码蛋白，最终通过蛋白序列来发挥功能，在做敲除的时候，某一个点的改变就可以导致这个序列翻译出来的蛋白序列发生改变，即移码突变，这样的突变就可以导致蛋白功能的丧失。
非编码基因是以RNA的形式作用，某个位点发生改变后很难使其丧失功能，除非这个位点是该序列发生作用的唯一位点（这种情况概率极小，相当于是基因组的定点突变），所以非编码的敲除需要在两端各设计一条gRNA来进行片段敲除，但这两条gRNA需要都能有效且同时切割才能敲除成功，所以非编码基因的敲除比较难做。
答：蛋白本身可能受多因素调控，RNAi是针对转录水平的调控，到蛋白多一步翻译，某些情况下不能保证mRNA完全与蛋白水平一致。
（1）该蛋白的半衰期比较长，导致在检测时，之前表达的蛋白还未降解，确定半衰期需要用测定半衰期的方法检测，具体是用一些蛋白合成抑制剂处理后，隔一定时间检测该蛋白的水平；这种情况可以建议客户多隔一段时间再检测；
（2）该蛋白有多种转录本，可能有不同isoform的蛋白，要确定下是不是这条siRNA是针对所有的转录本；
（3）另外最后的可能就是该基因的翻译效率较高，较少mRNA仍能维持较高的蛋白水平。
1）有两种荧光素酶，包括海肾荧光素酶（Ranilla Luciferase，rluc）和萤火虫荧光素酶（Firefil Luciferase，fluc），荧光素酶的发光不需要激发光，但是需要底物荧光素，前者底物是肠腔素，后者底物是D-荧光素（D-Luciferin）。大部分的发表文章通常使用萤火虫荧光素酶（fluc）用作报告基因，当然也有用双标记的，我们常规的载体带luc标记的是fluc。
（2）D-荧光素（D-Luciferin），包括D-荧光素钾盐和钠盐，二者在使用效果上无区别，在物理特征上荧光素钠盐溶解度会高于钾盐。但是在体内实验研究中，有更多的研究者倾
如果是先筛稳定株后注射入动物体内，用慢病毒，luc标记；如果病毒直接注射推荐带luc 的高滴度腺病毒或者 AAV；实验周期比较短（两周以内）同时要求快速检测，推荐腺病毒，实验周期长推荐 AAV，动物实验优推 AAV，注意不同血清型选择。
慢病毒通过自身的 3’和 5’LTR 整合入基因组，整合方式为非定向随机整合。