å¦‚æžœæ˜¯çŸæœŸå†…使用,4℃å¯ä»¥ä¿å˜ä¸€å‘¨å·¦å³ã€‚
MOI(multiplicity of infecti
åŸºå› æ•²é™¤ä¸€èˆ¬åˆ†ä¸ºä¸¤ç§æƒ…å†µï¼šä¸€ç§æ˜¯æŠŠç›®çš„åŸºå› çš„DNA外显åç¼–ç åºåˆ—å…¨éƒ¨æ•²é™¤ï¼›ç¬¬äºŒç§æ˜¯æ•²é™¤å¤–显å上部分编ç 蛋白的åºåˆ—ï¼Œå› ä¸ºæ•²é™¤çš„å¤–æ˜¾ååºåˆ—为éžä¸‰çš„æ•´æ•°å€ï¼Œæ‰€ä»¥è¿™ç§æƒ…å†µä¼šé€ æˆè›‹ç™½ç¿»è¯‘ç§»ç çªå˜ï¼Œä»Žè€Œè¿›ä¸€æ¥å®žçŽ°äº†ç›¸åº”è›‹ç™½åŠŸèƒ½çš„æ•²é™¤ã€‚å› æ¤å¦‚æžœé€šè¿‡å¯¹ç›®æ ‡åºåˆ—进行
zsGreenå¯ä»¥æ´»ä½“æˆåƒè§‚察,但是
qPCR引物最好跨内å«å设计
è´´å£ä¸ç‰¢å’ŒåŠè´´å£ç»†èƒžå°½é‡ä½¿ç”¨æµ“度0.05%ä¸å«EDTA的胰酶
æ„ŸæŸ“å¤æ•°ï¼ˆMOI)
å½±å“è½¬æŸ“æ•ˆçŽ‡çš„å› ç´ ä¸»è¦æœ‰ä»¥ä¸‹å‡ 点:
ç»†èƒžå› ç´ ï¼Œç»†èƒžçš„çŠ¶æ€å¯¹è½¬æŸ“效率的影å“较大。è¦ç¡®ä¿ç»†èƒžæœªè¢«æ±¡æŸ“以åŠç»†èƒžå¤„在对数期。如果是贴å£ç»†èƒžçš„è¯ï¼Œè´´å£çŽ‡åº”è¯¥åœ¨50%~70%。转染时细胞密度过高或者过低都会导致转染效率é™ä½Žï¼Œä¹ƒè‡³è¡¨è¾¾æ°´å¹³å低。
一般在转染24-72h之间å¯ä»¥è¿›è¡Œè½¬æŸ“效率的观察验è¯ã€‚
最简å•直接的方法是通过è§å…‰è§‚察。一般å¯ä»¥é€šè¿‡è´¨ç²’载体上的è§å…‰è›‹ç™½åŸºå› ,或者å°å¹²æ‰°RNA带的è§å…‰åŸºå›¢ï¼Œæ¥é€šè¿‡è§å…‰æ˜¾å¾®é•œè§‚察细胞
当多质粒共转染时,å¯ä»¥å°†è´¨ç²’按照一定的比例进行混åˆï¼Œä¹‹åŽæ ¹æ®æ ¸é…¸æ€»é‡å†ä¸Žè½¬æŸ“试剂按照åˆé€‚的比例混åˆé…ç½®å³å¯ã€‚
当需è¦DNAå’ŒRNA共转染时,å¯ä»¥ä½¿ç”¨DNA转染试剂,如果å•独转RNA,建议使用RNA专用转染试剂。
针对siRNA的转染å¯ä»¥é€‰æ‹©RNA专用转染试剂RNAFit。针对质粒DNA的转染å¯ä»¥é€‰æ‹©LipoFiter转染试剂,改转染试剂适用于普通细胞系转染,具有低细胞毒性的特点。高级版的LipoFiter 3.0高效转染试剂,适用于普通细胞系和难转染细胞系,具有æžé«˜çš„转染效率。如果有慢病毒包装的实
一般在转染24-72h之间å¯ä»¥è¿›è¡Œè½¬æŸ“效率的观察验è¯ã€‚
最简å•直接的方法是通过è§å…‰è§‚察。一般å¯ä»¥é€šè¿‡è´¨ç²’载体上的è§å…‰è›‹ç™½åŸºå› ,或者å°å¹²æ‰°RNA带的è§å…‰åŸºå›¢ï¼Œæ¥é€šè¿‡è§å…‰æ˜¾å¾®é•œè§‚察细胞
血清一度曾被认为会é™ä½Žè½¬æŸ“效率,在开始准备DNA和阳离å脂质体试剂稀释液时è¦ä½¿ç”¨æ— 血清的培养基。血清ä¸å«æœ‰å¤§é‡çš„蛋白质,在转染过程ä¸ï¼Œå¸¦è´Ÿç”µçš„蛋白质å¯èƒ½å¹²æ‰°é˜³ç¦»å脂质体/阳离åèšåˆç‰©å¯¹æ ¸é…¸çš„å¸é™„,影å“转染效率。但在å¤åˆç‰©å½¢æˆåŽï¼Œåœ¨åŠ å…¥ç»†èƒžä¸å‰å¯ä»¥åŠ å…¥è¡€æ¸…ã€‚å½“ç„¶ï¼Œæœ€å¥½æ˜¯æŒ‰ç…§è½¬æŸ“è¯•å‰‚è¯´æ˜Žä¹¦çš„è¦æ±‚æ¥è¿›è¡Œæ“作。
细胞的生长状æ€ä¼šç›´æŽ¥å½±å“转染效果。转染å‰ç»†èƒžæœ€å¥½ç»è¿‡1-2æ¬¡ä¼ ä»£ï¼Œç»†èƒžè‰¯å¥½çš„ç”Ÿé•¿çŠ¶æ€æœ‰åŠ©äºŽæé«˜è½¬æŸ“æ•ˆçŽ‡ã€‚æœ‰äº›ç»†èƒžç³»ä¼ ä»£å¾ˆå¤šæ¬¡è¿˜èƒ½å¤Ÿä¿è¯å¾ˆé«˜çš„è½¬æŸ“æ•ˆçŽ‡ï¼Œè€Œå…¶ä»–ä¸€äº›ç»†èƒžç³»åˆ™ä¼ ä»£å¾ˆå°‘æ¬¡æ•°è½¬æŸ“æ•ˆçŽ‡å°±æœ‰æ˜¾ç€é™ä½Žï¼Œå€¼å¾—注æ„的是,贴璧细胞一旦长满就ä¸å®¹æ˜“转染了。
ç”¨äºŽè½¬æŸ“çš„ç»†èƒžå¯†åº¦æ ¹æ®ä¸åŒçš„细胞类
å¤–æºæ ¸é…¸çš„è´¨é‡ç›´æŽ¥å½±å“到转染效率从而影å“到实验结果。
一般æ¥è¯´ï¼Œç”¨äºŽè½¬æŸ“级别的质粒一定è¦é«˜çº¯åº¦ã€é«˜æµ“度ã€ä¸”æ— å†…æ¯’ç´ ã€‚æµ“åº¦è¦æ±‚ä¸ä½ŽäºŽ500ng/ul,1000 ng/ul为宜,OD260/280>1.8。
æœ‰ä¸¤ç§æ–¹æ³•ï¼Œä¸€ç§æ˜¯é€šè¿‡çœŸæ ¸ç»†èƒžæŠ—性è¯ç‰©ç›é€‰ï¼›ä¸€ç§æ˜¯è®©ç»†èƒžå¸¦ä¸Šè§å…‰ä¿¡å·ï¼Œåˆ©ç”¨æµå¼ç»†èƒžä»ªåˆ†é€‰å¾—到è§å…‰ä¿¡å·é˜³æ€§çš„细胞,扩大培养