为什么我做实验用腺相关病毒（ aav） 体外感染效率很低 (AAV 在细胞上的表达远比不上在动物体内的表达)？
想咨询一下，你们公司小鼠逆转录病毒转染CD4 T细胞的推荐MOI是多少呀，因为试用装的体积太少，我们不够试很多梯度，能否给个参考MOI值，我们好设的窄一点，节约病毒
PAM序列不应作为sgRNA的一部分。
AAV一般是可以维持3个月到半年，在这个时间内理论上
可以，要选择化学修饰的siRNA，恰当的修饰能够增加siRNA 的体内稳定性（抵抗核酸酶降解），和对组织的亲和力。
Mimics（双链）：模拟生物体内源的miRNAs，
最简单的是可以通过puro筛选检测：于感染后72小时加入工作浓度的嘌呤霉素，培养2-3天，镜下观察，选取细胞存活率较高且细胞状态较好的组，对应为较适宜的MOI值。另外，还可以通过目的基因的qPCR、WB、免疫荧光、免疫组化等方法摸索最佳MOI。
支原体：高倍镜下见小黑点，对PH 值影响较大，细胞换液后很快培养基变黄，换液后有一定改善但是培养后继续增多，可以pcr检测鉴定
黑胶虫：高倍镜下见小黑点，做布朗运动，换液不会改善
一般可用生理盐水稀释
AAV是单链DNA病毒，Adv是双链DNA病毒。AAV病毒基因组入核后要先合成双链DNA，才能开始后面的表达；腺病毒入核就可以开始后面的转录表达，所以两者的表达时间会有差距。如果实验周期短可选择腺病毒，纯化后的腺病毒在体内理论上可维持表达1-3周；如果实验周期较长，则可选择AAV，AAV理论上能在体内维持表达3-6个月。
慢病毒感染细胞用puromycin筛选得到稳转株之后，需要定期使用含有puromycin的培养基培养细胞，以免出现基因丢失的情况。建议后期培养浓度可以按照1/10~1/2的筛选浓度。
干扰表达的是shRNA，是 RNA 水平的表达，载体转染细胞后表达出 RNA，然后行驶功能。Flag是8个氨基酸构成的短肽，氨基酸是蛋白质的基本单位，需要翻译，flag与蛋白一起翻译，可以看做是一个融合蛋白。所以两者不是一个层次的表达，一个是RNA水平，一个是蛋白水平的表达。而 zsgreen、puro 是蛋白基因，表达的时候使用独立的启动子启动表达，是一个不同于RNA表达的单独表达单位，两者在一个载体上表达，互不影响。
circRNA的干扰靶点只能在接头位置设计。如果设计在其它位置可能会影响母基因的表达；为了达到干扰的特异性，只能跨接头设计。
一个FLGA是8个氨基酸，3FLGA就是24个氨基酸；一个氨基酸的平均分子量是0.110 KDa，所以3FLGA大小是2.64KDa；举个例子，一个蛋白是53KDa（P53)，加上 3FLGA 标签之后就是55-56KDa。用目的基因抗体检测的时候可能会看到两条带，本底的一条和外源表达的一条，但是很多时候两条带会在一起形成一条比较粗的条带；用 FLGA 抗体检测的时候，只能看到一条外源表达的条带。
空载体上的3FLGA一般是不能表达的，因为一般3FLGA之前不会再特意加上 ATG；就算特意加上ATG了，一是形成的蛋白太短
什么时候动物实验 选择使用腺病毒而不是腺相关病毒
加入腺病毒后，目的细胞死亡很厉害，为什么？
Polybrene 是什么？在慢病毒颗粒感染中， ，Polybrene 添加越多越好吗？
敲入和敲除有什么不同
什么时候需要构建稳转株？稳转株一般要用在什么实验上？
加入 腺 病毒后，目的细胞死亡很厉害，为什么？我要提问
目的细胞用腺病毒感染，但是荧光强度很弱，为什么？
通常在 腺病毒 转移载体中最大能够插入多大的目的基因序列?
腺病毒（adenovirus，Ad）感染后大部分细胞会在36-48h左右GFP或目的基因表达达到峰值，但是对于生长缓慢的细胞，达到峰值的时间会更长。
每种病毒有自己的载体容量，基因的插入会影响位于其下游的荧光蛋白等基因的表达。对照病毒或干扰病毒，由于没有插入基因或者插入基因非常短，荧光通常较强。而插入了较长基因之后，荧光的亮度会随着插入基因的长度以及特殊结构的存在等而减弱，尤其是出现高GC片段，由于影响了转录，荧光强度会大大降低。
首先，确定细胞或病毒是否有污染；其次，确定病毒感染MOI是否过高，调整MOI值，并在感染后的4h、8h对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液；排除以上因素后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转。如果使用慢病毒（lentivirus，LV）发生同样的情况，也可以参照以上因素进行分析哦。
需要根据细胞大小和增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后2天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。针对大部分细胞系：传代周期在2-3天，感染时细胞铺板的密度保持在30-50%左右，则细胞增殖48h后细胞汇合度约在90%左右；针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到50-60%左右，但要确保在感染后2天时细胞汇合度达到90-100%；针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种
做细胞永生化推荐什么病毒？
启动子活性验证，必须要过表达一个转录因子么？
腺相关病毒（AAV） 注射一次在多长时间内都有敲低/过表达的效果？
能列举下常用蛋白标签有那些以及他们的用途吗，用这些标签会不会增加蛋白的相对分子量？