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最后活动于2023-10-26
回复了主题  › 体外实验可以使用带特异性启动子的AAV(腺相关病毒)感染目的细胞吗?就是很多细胞混在一起只感染目的细胞。

体外实验特异性启动子的特异性倾向不太行,建议从细胞提取培养分离入手,把目的细胞分离出来做实验。

«  2023-10-26
回复了主题  › 质粒转染细胞,我看好多文章写转染过程中要用无血清的培养基,这是为什么呀?

血清中含有大量的蛋白质,在转染过程中,带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体/阳离子聚合物对核酸的吸附,影响转染效率。

«  2023-10-26
回复了主题  › 质粒内毒素是不是会导致细胞死亡啊?在什么范围内不会对细胞产生影响?

内毒素高的话会的。一般 <50EU/µg 可以用于转染细胞,基本上对细胞没有影响。

«  2023-10-26
回复了主题  › 用CRISPR/Cas9技术做敲除小鼠,Cas9和gRNA分别构建了AAV(腺相关病毒)打算尾静脉注射,请问是两个AAV同时注射100μl吗?

同时打的话病毒量可能有点大,小鼠不一定承受的了,可以两个AAV各注射50μl,一周后重复注射一次。

«  2023-10-26
«  2023-10-13
回复了主题  › miRNA表达量调控怎么检测表达及封闭效果?可以用qPCR吗?

Mimics可以用qPCR验证,但是miRNA inhibitor、antagomir以及miRNA干扰封闭等不适用,因为封闭是与miRNA发生结合从而抑制miRNA,并非改变miRNA的生成及降解,检测效果可以通过检测靶基因的表达水平进行验证。

«  2023-09-22
回复了主题  › 我的实验中需要将AAV注射入动物体内,如果买的病毒滴度比较高,要怎么稀释病毒产品,有特殊要求吗?

高滴度的AAV可以考虑减量注射,在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求,常规的动物试验用等渗溶液即可,如 PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完,在 2~8℃ 保存时间越短越好。

«  2023-09-22
回复了主题  › 一个细胞可以同时转4条siRNA吗?

可以的,混合起来转染就可以了,加起来总共是多少量就按照那个浓度加对应量的转染试剂。不过提前摸一下转染试剂的细胞毒性,转染试剂加多了可能对细胞状态有影响。

«  2023-09-22
回复了主题  › 请问腺相关病毒AAV会整合到宿主基因组吗?

实验中用到的假病毒即重组aav现在普遍不认为整合进基因组,频率很低。野生型的aav有研究过可能会整合到染色体的某个特定部位。

«  2023-09-22
回复了主题  › 我买了一个Cas9的慢病毒(lentivirus)穿梭质粒,打算自己包慢病毒,可以把这个质粒直接转到细胞里先验证下切割活性吗?

可以的,慢病毒穿梭质粒理论上是可以直接在真核细胞里表达的,搭配gRNA质粒验证即可。

«  2023-09-08
回复了主题  › 我看做miRNA和靶基因结合还可以用自由能预测,如果targetscan预测分数很低但是自由能预测结果还不错,以哪个为准呢?

两种预测方法都只能作为参考,具体还是要做实验,也有targetscan预测分数很低但实验结果显示有结合的情况。然后做实验还是以targetscan给出的结合位点或者种子区为准。

«  2023-09-08
回复了主题  › 干扰慢病毒(lentivirus)是根据基因的所有转录本的共同CDS设计的,做完干扰后想做个过表达回补实验,怎么做才能让外源过表达的基因不受干扰序列的影响呢?

一般通过在设计干扰序列对应的目的转录本的编码区CDS位置进行氨基酸同义突变即可不受干扰序列的影响,完成回补实验。

«  2023-09-08
回复了主题  › 做过表达,qPCR显示有过表达,但是WB没有过表达是为什么啊?

这原因很多了,转录后mRNA的剪接修饰和稳定性,或者调控因子比如miRNA的调控等等,都会影响翻译效率,从而影响蛋白的表达水平。总之,这个实验结果挺常见的。

«  2023-09-08
回复了主题  › 做病毒感染实验时,查到了一篇高分文献,跟我用的细胞一样的,也是用的慢病毒(Lentivirus),我是不是可以直接用人家摸索过的moi做感染?

不建议这么做,因为感染细胞的来源、状态以及病毒的生产过程对细胞感染病毒的MOI都有较大的影响。有条件的话,建议每拿到一株病毒都要做一次MOI摸索实验,以确定最好的感染效率。

«  2023-08-17
回复了主题  › 目的基因和荧光蛋白融合表达和非融合表达有什么区别?

融合表达后目的序列+荧光标记表达一个蛋白,荧光蛋白可以指示目的蛋白在细胞中的表达位置;非融合表达目的蛋白和荧光蛋白分开表达或表达后断裂成两个蛋白,最终是两个独立的蛋白。

«  2023-08-17