高滴度的AAV可以考虑减量注射，在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如 PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完，在 2~8℃ 保存时间越短越好。
可以的，混合起来转染就可以了，加起来总共是多少量就按照那个浓度加对应量的转染试剂。不过提前摸一下转染试剂的细胞毒性，转染试剂加多了可能对细胞状态有影响。
实验中用到的假病毒即重组aav现在普遍不认为整合进基因组，频率很低。野生型的aav有研究过可能会整合到染色体的某个特定部位。
可以的，慢病毒穿梭质粒理论上是可以直接在真核细胞里表达的，搭配gRNA质粒验证即可。
两种预测方法都只能作为参考，具体还是要做实验，也有targetscan预测分数很低但实验结果显示有结合的情况。然后做实验还是以targetscan给出的结合位点或者种子区为准。
一般通过在设计干扰序列对应的目的转录本的编码区CDS位置进行氨基酸同义突变即可不受干扰序列的影响，完成回补实验。
这原因很多了，转录后mRNA的剪接修饰和稳定性，或者调控因子比如miRNA的调控等等，都会影响翻译效率，从而影响蛋白的表达水平。总之，这个实验结果挺常见的。
不建议这么做，因为感染细胞的来源、状态以及病毒的生产过程对细胞感染病毒的MOI都有较大的影响。有条件的话，建议每拿到一株病毒都要做一次MOI摸索实验，以确定最好的感染效率。
融合表达后目的序列+荧光标记表达一个蛋白，荧光蛋白可以指示目的蛋白在细胞中的表达位置；非融合表达目的蛋白和荧光蛋白分开表达或表达后断裂成两个蛋白，最终是两个独立的蛋白。
两个病毒载体各加25比较好，慢病毒毒性相对来说比较大的，各加50细胞可能不太行。用25感染，如果效率低可以后期药筛。
药筛的话，悬浮细胞只能用低速离心慢慢去掉了，死细胞会随着传代换液代谢掉，如果病毒带荧光可以用流式筛选。
可以用qPCR检测，采用茎环法或者加尾法延长miRNA，然后设计对应引物就可以了。
目前用AAV9的文献比较多，之前有人改造了AAV9的衣壳蛋白，加了一段骨靶向序列(AspSerSer)6，提高了对骨器官的特异性，文献是这个https://doi.org/10.1038/s41467-019-10809-6，你可以看看。
Mimics可以用qPCR验证，但是miRNA inhibitor、antagomir以及miRNA干扰封闭等不适用，因为封闭是与miRNA发生结合从而抑制miRNA，并非改变miRNA的生成及降解，检测效果可以通过检测靶基因的表达水平进行验证。