抗体之前使用过没有问题的话，内源性基因都没检测到只能是上样量的问题了，是不是基因本底也比较低呀？可以扩大细胞培养量以提高提取的蛋白总量，建议先用空白细胞试，确定需要培养的细胞量。

建议选择AAV荧光的颜色避开二抗的颜色；或者AAV不带荧光，在目的蛋白上携带标签，再用标签抗体做第三个颜色的免疫荧光染色以便检测，但后者观察感染效率没有带光直接。

会有荧光丢失的细胞，一般只有整合到了宿主细胞染色体上的才不会丢失，但慢病毒整合也有一定的概率，所以也存在那种只是借助了宿主细胞转录翻译系统表达但没有整合的，这类细胞荧光可能就会逐渐丢失，一般如果携带了抗性基因的话在后续的培养过程中可以加入一定浓度的药物维持阳性细胞率；如果只带了荧光，后续通过荧光进行定期分选，维持阳性率，或者可以等阳性细胞比例下降到不适宜实验的范围再次做流式分选。

一般选择经典转录本，相关研究文章比较多，基因的结构、翻译修饰等信息比较详细，uniprot上显示基本就是经典转录本对应的氨基酸序列，和ncbi上的氨基酸序列比对找到对应的转录本。如果没有经典转录本可以考虑研究最长转录本。

如果基因名称和物种正确的话，两个网站启动子序列应该差不多的，差400bp应该是有一个网站方法不对。我之前也碰到过类似的情况，问了师姐是ncbi上基因方向搞错了。ncbi里genomic context板块显示基因的箭头，箭头往右，序列往前推2000bp，箭头往左，序列往后推2000bp。ucsc就不会有方向问题，所以一般先用ucsc找，没有再去ncbi查。你看看换个方向两个网站的序列是不是就差不多了。

腺病毒属于瞬转，无法将携带的基因整合到宿主的染色体上进行稳定的表达。用腺病毒感染没办法到达100%的感染效率的话，敲除就会不彻底，且后续无法筛选，如果做长期实验，后面细胞的阴性细胞比例会越来越高。结果不稳定很有可能是感染效率不稳定导致的，AdV-Cre病毒的转染只能达到敲低的效果（有感染的阴性细胞），且维持的时间也有期限。如果想实现敲除维持长期效果，一是可以对成功敲除的细胞进行单克隆培养；二是可以试试转染带抗性基因的慢病毒（Lentivirus，LV），在感染之后进行筛选，让宿主细胞稳定表达Cre酶。不过分离的原代细胞一般无法一直传代，这两种方案的可行度也要综合分析。

DIO和FLEX系统都属于Cre-on（条件性表达）。DIO系统：插入基因方向与启动子方向相反，在Cre重组酶不存在的情况下不表达，只有当Cre酶存在时，发生重组使基因方向与启动子方向一致，才能使该基因表达；FLEX系统：FLEX系统与DIO系统作用一致，只是LoxP位点方向与DIO系统不同：DIO的两个loxp位点方向相对，FLEX系统的两个loxp位点方向相背。这两种系统都可以满足题主的实验需求。

siRNA是直接合成的双链RNA，进入细胞内参与RNAi途径，使靶基因沉默。慢病毒携带的shRNA则需要先整合至细胞基因组，再利用细胞内的Dicer酶生成相应的siRNA，发挥RNAi作用。正常来讲siRNA的瞬时作用效果本来就比shRNA要好些，另外还需要考虑感染效率的问题，如果病毒感染效率不高，整合的shRNA就会更少，效果自然更差，这种情况建议可以通过药物筛选，提高阳性细胞的比例，理论上来说会提高一些敲低效率。另外，细胞内的信号一般都存在反馈机制，可能是目的基因本身的负反馈机制导致回补现象。

体外实验特异性启动子的特异性倾向不太行，建议从细胞提取培养分离入手，把目的细胞分离出来做实验。

血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体/阳离子聚合物对核酸的吸附，影响转染效率。

内毒素高的话会的。一般 <50EU/µg 可以用于转染细胞，基本上对细胞没有影响。

同时打的话病毒量可能有点大，小鼠不一定承受的了，可以两个AAV各注射50μl，一周后重复注射一次。

Mimics可以用qPCR验证，但是miRNA inhibitor、antagomir以及miRNA干扰封闭等不适用，因为封闭是与miRNA发生结合从而抑制miRNA，并非改变miRNA的生成及降解，检测效果可以通过检测靶基因的表达水平进行验证。

高滴度的AAV可以考虑减量注射，在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如 PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完，在 2~8℃ 保存时间越短越好。

可以的，混合起来转染就可以了，加起来总共是多少量就按照那个浓度加对应量的转染试剂。不过提前摸一下转染试剂的细胞毒性，转染试剂加多了可能对细胞状态有影响。

实验中用到的假病毒即重组aav现在普遍不认为整合进基因组，频率很低。野生型的aav有研究过可能会整合到染色体的某个特定部位。