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自己包的病毒感染细胞后能看见过表达,但是蛋白表达程度总是不够?怎么优化
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293t细胞包装病毒,包装时的10%DMEM中加入1%非必须氨基酸和丙酮酸钠,包装系统是PLVX-PURO(10 μg)、PSPAX2(7.5 μg)、PMD2G(2.5 μg)。在10cm皿中,收取48h(10ml)和72h(10ml)含病毒培养液,混合后用0.22微米的滤膜过滤,分装后保 ... (展开全部)

293t细胞包装病毒,包装时的10%DMEM中加入1%非必须氨基酸和丙酮酸钠,包装系统是PLVX-PURO(10 μg)、PSPAX2(7.5 μg)、PMD2G(2.5 μg)。在10cm皿中,收取48h(10ml)和72h(10ml)含病毒培养液,混合后用0.22微米的滤膜过滤,分装后保存于-80℃冰箱,使用前化冻,感染时六孔板中细胞融合率大约在50%,病毒体积设置了1ml、3ml、5ml梯度,polybrene浓度为5μg/mL,感染12h后换完全培养液,但是蛋白表达程度并没有随体积而增强,因为加入5ml病毒原液的皿中有很多细胞感染后死亡,所以我感觉病毒量应该够了,想不出原因,有人知道吗?

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  • 慢病毒
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6 天前
请问两种AAV病毒可以同时注射吗?我想注射一个敲除病毒,再注射一个突变体病毒,谢谢
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  • 病毒相关动物实验
  • 腺病毒
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22/10
跪求各位大神指点,看文献一般要求MOI=5或10,如果是这样加1ul病毒原液(TCID50=10-7.876/0.1ml)至6孔板就能达到这个要求,但是师姐们都采用加200 TCID50浓度1ml病毒液进行试验,但是如果按这个计算病毒液的话,和MOI算出来差了一个103个数量级,急求各位大师指点,我是哪里弄错了
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    07/10
    慢病毒转染过表达
    1回答 852浏览
    从公司买的慢病毒,看了说明书慢病毒感染细胞不要超过24小时,实验室师兄说可感染72小时都没事,只要细胞状态可以,我感染了48小时后换成正常培养基,细胞状态差点,48小时荧光已经很强,但今天做WB和contral组比没有差别(3组不同的细胞系),是不是感染时间太长,影响蛋白的合成,还是病毒的问 ... (展开全部)

    从公司买的慢病毒,看了说明书慢病毒感染细胞不要超过24小时,实验室师兄说可感染72小时都没事,只要细胞状态可以,我感染了48小时后换成正常培养基,细胞状态差点,48小时荧光已经很强,但今天做WB和contral组比没有差别(3组不同的细胞系),是不是感染时间太长,影响蛋白的合成,还是病毒的问题?(我的是分泌蛋白,细胞中表达量高,抗体CST的一秒就爆了)

       

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    • 慢病毒
    • 细胞感染
    1回答 852浏览
    29/08
    病毒几个结构蛋白的质粒转染细胞,收集细胞上清进行蔗糖密度梯度离心,得到病毒样颗粒用于WB实验。我需要转染多少细胞才能达到我WB的实验需求?
    1回答 784浏览
    我构建了新城疫病毒几个结构蛋白的质粒,据文献报导将这几个质粒共转染细胞,细胞上清中会含有病毒粒子。我想收集细胞上清,通过蔗糖密度梯度离心得到病毒粒子用于WB。想问问大家我如果通过蔗糖密度梯度离心得到病毒粒子,我质粒需要转染几皿细胞(10毫升)才能满足收集到的病毒粒子跑WB?

    我构建了新城疫病毒几个结构蛋白的质粒,据文献报导将这几个质粒共转染细胞,细胞上清中会含有病毒粒子。我想收集细胞上清,通过蔗糖密度梯度离心得到病毒粒子用于WB。想问问大家我如果通过蔗糖密度梯度离心得到病毒粒子,我质粒需要转染几皿细胞(10毫升)才能满足收集到的病毒粒子跑WB?

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      26/08
      用293T细胞扩病毒如何提高病毒的滴度呢?
      1回答 976浏览
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        1回答 976浏览
        15/08
        用293T细胞扩病毒如何提高病毒的滴度呢?
        1回答 940浏览
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          1回答 940浏览
          15/08
          请问不同血清型AAV病毒包装时的区别是什么?
          1回答 1380浏览
          请教各位大牛,经常看到AAV病毒不同血清型对不同组织器官的亲和力不同,奈何查不到不同的血清型病毒是如何来的,是否因包装载体不同而进行区分呢?有文献或者链接可以参考吗?

          请教各位大牛,经常看到AAV病毒不同血清型对不同组织器官的亲和力不同,奈何查不到不同的血清型病毒是如何来的,是否因包装载体不同而进行区分呢?有文献或者链接可以参考吗?

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          • AAV
          1回答 1380浏览
          08/07
          慢病毒转染大于15000bp质粒的效率如何
          1回答 2380浏览
          因实验需要,需要向乳腺癌细胞231中转染CRISPR融合蛋白质粒,如果不算慢病毒本身的骨架,就有有13000bp,加上慢病毒,可能就超过15000bp。现在很纠结要不要采用慢病毒包装,因为不知道慢病毒转染大质粒的效率。请教各位大佬

          因实验需要,需要向乳腺癌细胞231中转染CRISPR融合蛋白质粒,如果不算慢病毒本身的骨架,就有有13000bp,加上慢病毒,可能就超过15000bp。现在很纠结要不要采用慢病毒包装,因为不知道慢病毒转染大质粒的效率。请教各位大佬

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          • 慢病毒
          • 细胞转染
          1回答 2380浏览
          14/04
          有一逆转录病毒载体(含目的shRNA),该怎样选择包装质粒?要进行转化,继而转染癌细胞
          1回答 3220浏览
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            12/01
            他莫昔芬诱导cre小鼠条件表达的用量是多少?
            1回答 5312浏览
            谁用过他莫昔芬诱导cre小鼠条件表达的么?用量大概是多少呢?网上查的好像差别不一,有用过望告知下,感谢!

            谁用过他莫昔芬诱导cre小鼠条件表达的么?用量大概是多少呢?网上查的好像差别不一,有用过望告知下,感谢!

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            • 病毒相关动物实验
            1回答 5312浏览
            2018-12-14
            293bbs
            0回答 2892浏览
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              0回答 2892浏览
              2018-12-13
              233
              0回答 2688浏览
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                2018-12-13
                包AAV病毒三次冻融后取粗上清感染293发现没看到荧光,为什么?
                1回答 5282浏览
                在包AAV病毒,用的是心肌特异的启动子,质粒酶切鉴定都没问题,包出来的病毒,用lysis buffer三次冻融后取粗上清感染293发现没看到荧光。包的是GFP的质粒.是不是就算失败了。我本来想看到荧光再去纯化,要不纯化一次成本太高。但我真的不知道原因到底在哪里?转染效率挺高的,收病 ... (展开全部)

                在包AAV病毒,用的是心肌特异的启动子,质粒酶切鉴定都没问题,包出来的病毒,用lysis buffer三次冻融后取粗上清感染293发现没看到荧光。包的是GFP的质粒.是不是就算失败了。我本来想看到荧光再去纯化,要不纯化一次成本太高。但我真的不知道原因到底在哪里?转染效率挺高的,收病毒前拍照绿色荧光也挺亮的。求大神指点~

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                • AAV
                • 细胞感染
                1回答 5282浏览
                2017-03-09
                腺病毒扩大体系怎么说
                1回答 4708浏览
                腺病毒转染以前铺6孔板提取蛋白做WB,想能够多得到一些蛋白,直接在细胞培养瓶转染可以吗?提取蛋白操作都一样吗?谢谢大神呢

                腺病毒转染以前铺6孔板提取蛋白做WB,想能够多得到一些蛋白,直接在细胞培养瓶转染可以吗?提取蛋白操作都一样吗?谢谢大神呢

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                • 细胞感染
                • 腺病毒
                1回答 4708浏览
                2017-03-02
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